Бактеріологічні дослідження. Бактеріологічне дослідження Бактеріологічний метод діагностики інфекційних

Про компанію

Вас не влаштовує якість продукції в лабораторію? Спробуйте попрацювати із нами. Вся наша продукція виготовлена ​​за найвищими світовими стандартами, має реєстраційні свідоцтва МОЗ України. Переконайтеся у цьому власним досвідом. Зробіть пробне замовлення.

Бактеріологічні дослідження

Бактеріологічне дослідження- призначене для виділення бактерій та вивчення їх властивостей з метою постановки мікробіологічного діагнозу.
Досліджуваний матеріал слід брати в асептичних умовах у стерильний посуд та доставляти до лабораторії якнайшвидше. У разі потреби проби слід зберігати на холоді. Методика взяття проб залежить від об'єкта, характеру захворювання та властивостей мікроорганізму. Одним із найпоширеніших прийомів бактеріологічного дослідження є бактеріоскопія.
Для вивчення нефіксованих бактерій користуються двома методами: розчавленої (між предметним та покривним склом) краплі та висячої краплі. Слід пам'ятати, що препарати нефіксованих бактерій є заразними.
До найважливіших елементів бактеріологічного дослідження відносяться посіви і пересівання бактеріальних культур, що виробляються бактеріальною петлею або пастерівської піпеткою. Петлю стерилізують прожарюванням в полум'ї, потім її остуджують дотиком до ділянки незасіяного агару або ополіскуючи у стерильній рідині. При використанні пастерівської піпетки її кінчик обламують пінцетом, кілька разів проносять піпетку через полум'я пальника і дають охолонути. При посівах використовують рідкі та тверді живильні середовища. При сівбі на скошений агар культуру бактерій розтирають петлею поверхнею агару. При сівбі в товщу агарового або желатинового стовпчика живильне середовище проколюють до дна пробірки петлею або особливою голкою. При сівбі в рідке середовище треба стежити, щоб рідина не виливалася і не змочувала краї пробірок та пробки. Посіви та пересівання слід проводити поблизу полум'я газового пальника, пробірки не повинні довго залишатися відкритими, петля чи пастерівська піпетка з культурою не повинна ні до чого торкатися; перед тим як закривати пробірку, краї слід пропалити. Засіяні пробірки необхідно відразу надписати.

Мікробіологічні методи дослідження поділяються наметоди прямого виявлення збудника в організмі хворого - бактеріоскопічне та бактеріологічне дослідження; методи непрямого доказу наявності збудника в організмі хворого - серологічні дослідження, спрямовані на виявлення специфічних антигенів в інфікованому матеріалі або антитіл у сироватці крові та різних секретах організму хворого.
Бактеріоскопічне дослідження крові, сечі, спинномозкової рідини, слизу зі зіва і носа, калу та різних патологічних субстратів на присутність збудника застосовують при багатьох інфекційних хвороб. Цей метод має досить обмежене застосування, хоч і дуже важливий. Він використовується, зокрема, для виявлення в крові збудників малярії, тифу, лептоспірозу. Спинномозкову рідину досліджують при гнійному та туберкульозному менінгіті, слиз із зіва та носа – при дифтерії, ангіні Венсана, кал – при амебіазі, балантидіазі, лямбліозі; сечу – при лептоспірозі. Палички чуми, сибірки можна побачити в пунктаті чумного бубона і мазках-відбитках, взятих з сибірки карбункула; при мікроскопії мазка пунктату з кісткового мозку та селезінки, грануляцій з виразки можна виявити лейшманії; у харкотинні - мікобактерії туберкульозу. Перевага бактеріоскопічного методу полягає у його швидкості. Результати аналізу можуть бути отримані за кілька годин. При деяких захворюваннях (малярія, епідемічний цереброспінальний менінгіт та ін) збудники можуть бути виявлені в організмі хворого вже в 1-й день хвороби, що дуже важливо для своєчасної діагностики та лікування. Значно розширилися можливості бактеріоскопічної діагностики завдяки обробці препаратів специфічними сироватками, що містять антитіла до цього збудника, мічені флуорохромами (імунофлуоресцентний метод) або ферментами (імуноферментний метод). При цьому мічені антитіла з'єднуються з антигеном, який виявляється при імунофлуоресцентному методі під люмінесцентним мікроскопом, а при імуноферментному методі – за фарбування продукту ферментативної реакції після введення субстратно-індикаторної суміші.
Бактеріологічний методдіагностики заснований на виділенні збудника з крові, спинномозкової рідини, мокротиння, слизу зі зіва і носа, калу, сечі, жовчі хворого, а при летальних наслідках - зі шматочків органів, які засівають на спеціальні живильні середовища. Бактеріологічна діагностика широко використовується для дослідження слизу зі зіва та носа на дифтерійні бактерії, для виділення збудників кишкових інфекцій(наприклад, холери, дизентерії, сальмонельозів, ешеріхіозів) з калу хворого, збудників пневмонії – з мокротиння та в інших випадках. При цьому враховують особливості передбачуваної інфекції, місце виборчої локалізації збудника та шляхи його виділення у довкілля. Дослідження дає позитивні результати вже у перші години чи дні хвороби. Однак остаточну відповідь лабораторія при більшості інфекційних хвороб повідомляє лише через 2-4 дні, а при бруцельозі, туберкульозі – через 3-4 тижні. Це залежить від термінів, потрібних для зростання мікроорганізмів та їх ідентифікації (біохімічної та серологічної). Кожен мікроб для свого зростання вимагає відповідного живильного середовища. Залежно від того, який мікроб припускають виділити (що визначається при клінічному та епідеміологічному обстеженні хворого), вибирають відповідне живильне середовище. Іноді посів виробляють одночасно кілька поживних середовищ. Цінність результатів бактеріологічних досліджень багато в чому визначається тим, чи правильно взято матеріал у хворого і чи правильно його доставлено до лабораторії. Інфекційний матеріал збирають у стерильний посуд, дотримуючись правил асептики.

Найважливішим етапом бактеріологічного дослідження є ідентифікація- Визначення видової або типової приналежності бактерій, отриманих у вигляді чистої культури. При ідентифікації бактерій проводиться вивчення їх фізіологічних та біохімічних властивостей, токсиноутворення. Широко використовують серологічні методи ідентифікації бактерій. У багатьох випадках ефективним виявляється біологічний метод ідентифікації мікроорганізмів, заснований на зараженні лабораторних тварин матеріалом, що досліджується, або отриманою культурою бактерій і виявленні у тварин характерних патологічних змін.
Для виділення чистих культур використовують механічні та біологічні методи. Приклад механічного методу: краплю досліджуваного матеріалу розтирають тим самим стерильним шпателем або бактеріальною петлею по поверхні щільного живильного середовища, послідовно в першій, другій і третій чашках Петрі. Виділення чистої культури проводиться з окремих колоній, що виросли, і полягає в їх дослідженні та відсіві на свіже живильне середовище. Біологічні методи виділення чистих культур засновані на обліку тієї чи іншої властивості мікроба, що виділяється, що відрізняє його від інших мікробів, що знаходяться в досліджуваному матеріалі.
При біологічному методі використовують такого роду живильні середовища, у яких створено умови, сприятливі у розвиток певного виду мікробів. До біологічних методів відноситься також зараження лабораторних тварин, чутливих до виду бактерій, що виділяється.
Бактеріологічне дослідження - комплекс методів виявлення патогенних мікроорганізмів у хворого, у носія чи об'єктах зовнішнього середовища.

Виділення чистої культури;

Методи бактеріологічного дослідження дедалі ширше впроваджуються у практику для детальнішого обстеження хворих, встановлення етіологічного фактора запального процесу, призначення раціональної терапії та визначення її ефективності

Різноманітність клінічного матеріалу та своєрідність мікрофлори окремих органіввизначають особливості методів бактеріологічного дослідження, які вимагають застосування спеціальних прийомів відбору проб, посівів на живильні середовища та проведення перебігу аналізів.

Бактеріологічне дослідження клінічного матеріалу складається з кількох етапів:

Відбір проб для дослідження;

посів на живильні середовища;

Виділення чистої культури;

Ідентифікація та диференціація виділених культур мікроорганізмів;

Аналіз результатів дослідження.

При бактеріологічному дослідженні проводять так званий посів зібраного у хворого матеріалу на живильні середовища, що сприяє зростанню та розмноженню збудника захворювання. У результаті дослідження можна виявити як сам факт наявності, а й концентрацію патогенних мікроорганізмів у тому чи іншому біоматеріалі.
Методом бактеріологічного дослідження досліджують мокротиння, ліквор, кров, а також відокремлюване із статевих органів, ротової порожнини, зіва і ран пацієнта. Таким чином, мікроорганізми можна висівати практично з будь-якої ділянки організму людини.
Методика бактеріологічного посіву надзвичайно зручна та ефективна для виявлення та визначення виду бактерій та грибків. Певну складність є виявлення вірусів у зв'язку з особливостями їх біології.
Бактеріологічне дослідження (посіви) має велике значення як визначення конкретного типу мікроорганізму, а й встановлення ступеня чутливості щодо нього тієї чи іншої антибіотика. Отже, визначається максимальна ефективність тієї чи іншої виду антибіотикотерапії.
При проведенні аналізу важливо пам'ятати, деякі мікроорганізми, наприклад пневмококи, досить швидко гинуть, оскільки мають підвищену тенденцію до саморуйнування. Таким чином, посіви необхідно робити у короткий термін.

Культуральний (бактеріологічний) метод дослідження - сукупність способів, спрямованих на виділення та ідентифікацію чистих культур мікроорганізмів (бактерій) за допомогою культивування на живильних середовищах.

Чиста культура – ​​сукупність мікроорганізмів одного виду. Найчастіше чисту культуру одержують шляхом відбору та культивування ізольованої колонії (потімство однієї мікробної клітини).

Етапи методу:

1. Забір матеріалу на дослідження.

2. Виділення чистої культури та її ідентифікація.

3. Висновок.

Забір матеріалу на дослідження.Вид досліджуваного матеріалу залежить від мети дослідження (діагностика – від хворого; епіданаліз – із зовнішнього середовища, продуктів харчування, хворого та (або) бактеріоносія).

Виділення чистої культури. Включає 3 або 4 етапи:

1. Посів матеріалу (після попередньої мікроскопії) на чашку з щільним живильним середовищем (краще диференційно-діагностичним або селективним) з метою отримання ізольованих колоній. Виробляють його найчастіше методом механічного роз'єднання. У деяких випадках (наприклад, кров) матеріал попередньо засівають у рідке середовище збагачення з подальшим пересіванням на чашку з агаровим середовищем. Іноді до посіву проводять селективну обробку матеріалу (з урахуванням властивостей мікроорганізму, що виділяється; наприклад, обробка кислотою або лугом для виділення стійких бактерій). Культивують при температурі 37°С протягом 18-24 годин. Час культивування для різних видівбактерій може коливатися.

2(3):а) вивчення колоній на чашці з агаром (культуральні ознаки), відбір найбільш типових; б) приготування мазків із цих колоній з забарвленням (за Грамом або іншими методами); а) відсівання залишку дослідженої колонії на середовище накопичення та вирощування в термостаті при оптимальній температурі.

3(4). Вивчення чистоти культури, отриманої серед накопичення. З цією

метою готують мазок, фарбують (частіше за Грамом), мікроскопічно вивчають

морфологічну та тинкторіальну однорідність (у різних полях зору).

4(5). Ідентифікація чистої культури.

Висновок.За сукупністю ознак у порівнянні з властивостями еталонних (типових) штамів вказується вид виділеного з матеріалу мікроорганізму.

Оцінка методу:

переваги:відносно висока чутливість та точність, можливість визначити чисельність мікробів у досліджуваному матеріалі, а також чутливість до антибіотиків; недоліки:відносна тривалість, метод дорогий.

21. Поживні середовища для аеробів та анаеробів. Вимоги до поживних середовищ класифікація.

Вимоги:

середовища мають бути поживними

повинні мати певні ph

мають бути ізотонічними, тобто. осмотичний тиск у середовищі має бути такий самий як у клітині.

повинні бути вологими і не надто рідкими

повинні облпдпть певним окислювально-відновним потенціалом

повинні бути стерильними

мають бути уніфікованими, тобто. містити постійні кількості окремих інгредієнтів.

Поживні середовища можна поділити:

А) За походженням:

1) природні – натуральні продукти харчування (м'ясо, молоко, картопля);

2) штучні - приготовані спеціально для вирощування мікробів: - середовища з природних продуктів (м'ясна вода, м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), - які не мають постійного складу; - синтетичні живильні середовища - розчини строго певних кількостей солей, амінокислот, азотистих основ, вітамінів у дистильованій воді - мають постійний склад, що використовуються для вирощування мікроорганізмів та культур клітин при отриманні вакцин, імунних сироваток та антибіотиків;

Б) За призначенням:

1) загального призначення (МПБ, МПА) – ними зростає більшість мікробів;

2) елективні - вибірково сприяють зростанню одного виду мікробів із суміші (наприклад, жовтково-сольовий агар для стафілококів);

3) диференціально-діагностичні - дозволяють віддиференціювати на вигляд середовища один вид мікроба від інших (наприклад середовища Ендо, Левіна для кишкової групи мікробів).

Крім того, в залежності від цілей використанняу схемі виділення чистих культур, за призначенням можна виділити такі середовища:

1) збагачення - пригнічують зростання бактерій, супутніх збуднику;

2) для одержання ізольованих колоній;

3) накопичення чистої культури;

В) За консистенцією:

1) рідкі;

2) напіврідкі (при додаванні агар-агару концентрації 0,5-0,7%);

3) щільні – вище 1%.

Бактеріологічний метод дослідження (БЛМІ)– метод, заснований на виділенні чистих культур бактерій за допомогою культивування на живильних середовищах та їх ідентифікації до виду на підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, генетичних, серологічних, біологічних, екологічних характеристик мікроорганізмів.

Бактеріологічну діагностику інфекцій проводять за допомогою стандартних діагностичних схем, затверджених Міністерством охорони здоров'я.

Чиста культурабактерії одного виду, вирощені на живильному середовищі, властивості яких у процесі вивчення.

Штам- Ідентифікована чиста культура мікроорганізмів одного виду, виділена з певного джерела у певний час. Штами одного виду можуть несуттєво відрізнятися біохімічними, генетичними, серологічними, біологічними та ін. властивостями, а також місцем та часом виділення.

Цілі БЛМІ:

1. Постановка етіологічного діагнозу: виділення чистої культури мікроорганізмів та її ідентифікація.

2. Визначення додаткових властивостей, наприклад, чутливості мікроорганізму до антибіотиків та бактеріофагів.

3. Визначення кількості мікроорганізмів (важливо у діагностиці інфекцій, що викликаються УПМ).

4. Типування мікроорганізмів, т. е. визначення внутрішньовидових відмінностей виходячи з вивчення генетичнихі епідеміологічних(фаговарів та сероварів) маркерів.Це використовується в епідеміологічних цілях, тому що дозволяє встановити спільність мікроорганізмів, що виділяються від різних хворих та з різних об'єктів зовнішнього середовища, у різних стаціонарах, географічних регіонах.

БЛМІ включає кілька етапів,різних для аеробів, факультативних анаеробів та облігатних анаеробів.

I. Етапи БЛМІ при виділенні чистої культури аеробів та факультативних анаеробів.

Етап.

А. Паркан, транспортування, зберігання, попередня обробка матеріалу.Іноді до сівби проводять селективну обробку матеріалу з урахуванням властивостей мікроорганізму, що виділяється. Наприклад, перед дослідженням мокротиння або іншого матеріалу на присутність кислотостійких мікобактерій туберкульозу, матеріал обробляють розчинами кислот або лугів.

Б. Посів у середу збагачення(при необхідності). Його проводять, якщо в досліджуваному матеріалі міститься мала кількість бактерій, наприклад, при виділенні гемокультури. Для цього кров, взяту на висоті лихоманки у великому обсязі (8–10 мл у дорослих, 4–5 мл у дітей), засівають у середу у співвідношенні 1:10 (для подолання дії бактерицидних факторів крові); посів інкубують при температурі 37°С 18-24 год.

В. Мікроскопія досліджуваного матеріалу.З досліджуваного матеріалу готують мазок, фарбують його за Грамом або іншим методом і мікроскопують. Оцінюють наявну мікрофлору, її кількість. У ході подальших досліджень мають бути виділені мікроорганізми, які були присутні в первинному мазку.

Г. Посів на живильні середовища для одержання ізольованих колоній.Виробляють посів матеріалу петлею або шпателем методом механічного роз'єднання на чашку з диференційно-діагностичним або селективним середовищем з метою одержання ізольованих колоній. Після посіву чашку перевертають дном догори (щоб уникнути розмазування колоній крапельками конденсаційної рідини), підписують та поміщають у термостат при температурі 37 0 С на 18-24 год.

Слід пам'ятати, що при посівах та пересіваннях мікробних культур увага працюючого має бути звернена на дотримання правил асептики для попередження контамінації поживних середовищ та попередження зараження оточуючих та самозараження!

У разі інфекцій, що викликаються умовно-патогенними мікроорганізмами, де має значення кількість присутніх мікроорганізмів у патологічному матеріалі, роблять кількісний посів матеріалу, для чого попереднього готують ряд 100-кратних розведень матеріалу (зазвичай 3 розведення) у стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду в пробірках. Після чого по 50 мкл кожного розведення висівають на живильні середовища у чашках Петрі.

Етап.

А. Вивчення морфотипів колоній на середовищах, їхня мікроскопія.Переглядають чашки та відзначають оптимальне живильне середовище, швидкість росту, характер зростання мікроорганізмів. Для вивчення обирають ізольовані колонії, розташовані по ходу штриха, ближчі один до центру.Якщо зростає кілька типів колоній – кожен досліджується окремо. Оцінюють ознаки колоній (табл. 7). При необхідності чашки з посівами переглядають через лупу або за допомогою мікроскопа з об'єктивом малого збільшення та звуженою діафрагмою. Вивчають тинкторіальні властивості морфотипів колоній, що відрізняються, для цього з частини досліджуваної колонії готують мазок,фарбують за Грамом або іншими методами, мікроскопують і визначають морфологію чистоту культури.При необхідності ставлять орієнтовну РА на скліз полівалентними сироватками.

Б. Накопичення чистої культури.Для накопичення чистої культури ізольовані колонії всіх морфотипів пересівають в окремі пробірки зі скошеним агаром або будь-яким іншим живильним середовищем і інкубують у термостаті при +37 0 С (така температура оптимальна для більшості мікроорганізмів, але може бути і інший, наприклад, для Campylobacterium spp.- +42 0 C, Candida spp. та Yersinia pestis- +25 0 C).

Як середовище накопичення для ентеробактерій зазвичай використовують середовище Кліглеру.

Склад середовища Кліглера:МПА, 0,1% глюкози, 1% лактози, реактив на сірководень (сірчанокисле залізо + тіосульфат натрію + сульфіт натрію), індикатор феноловий червоний. Початковий колір середовища малиново-червоний, середовище «скошено» в пробірках: має стовпчик (2/3) та скошену поверхню (1/3).

Посів у середу Кліглера проводиться штрихом по поверхні та уколом у стовпчик.

Етап.

А. Облік зростання середовищі накопичення, оцінка чистоти культурив мазку за Грамом. характер зростаннявиділення чистої культури. Візуально чиста культура характеризується однорідним зростанням. При мікроскопічному дослідженнізабарвленого мазка, приготованого з такої культури, в ньому в різних полях зору виявляються морфологічно та тінкторіально однорідні клітини. Однак у разі вираженого плеоморфізму, властивого деяким видам бактерій, у мазках із чистої культури можуть зустрічатися одночасно клітини з різною морфологією.

Якщо як середовище накопичення використовували індикаторне середовище Кліглеру, то оцінюють зміни її кольору в стовпчику та скошеній частині, за якими визначають біохімічні властивості: ферментацію глюкози, лактози та продукцію сірководню. При розкладанні лактози жовтіє скошена частина середовища, при розкладанні глюкози жовтіє стовпчик. При утворенні CO 2 у процесі розкладання цукрів утворюються газові бульбашки або розрив стовпчика. У разі продукції сірководню відзначається почорніння по ходу уколу через перетворення сульфату заліза на сульфід заліза.

Характер зміни кольору середовища Кліглера (рис. 23) пояснюється неоднаковою інтенсивністю розщеплення мікроорганізмами азотистих речовин та утворення лужних продуктів в аеробних (на скошеній поверхні) та анаеробних (у стовпчику) умовах.

В аеробних умовах на скошеній поверхні відбувається більш інтенсивне лугоутворення, ніж у стовпчику середовища. Тому при розкладанні глюкози, що присутня в середовищі в невеликій кількості, кислота, що утворюється на скошеній поверхні, швидко нейтралізується. У той же час при розкладанні лактози, що присутня в середовищі високої концентрації, лужні продукти не здатні нейтралізувати кислоту.

В анаеробних умовах у стовпчику лужні продукти утворюються у незначній кількості, тому тут виявляється ферментація глюкози.

Мал. 23.Індикаторне середовище Кліглеру:

1 – вихідна,

2 – зі зростанням E. coli,

3- зі зростанням S. paratyphi B,

4 зі зростанням S. typhi

E. coliрозкладають глюкозу та лактозу з газоутворенням, не продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика та скошеної частини з розривами середовища.

S. paratyphiрозкладають глюкозу з газоутворенням, лактозонегативні. Вони викликають пожовтіння стовпчика з розривами, скошена частина не змінює колір і залишається малиновою. При цьому S. paratyphi Bпродукують сірководень (по ходу уколу з'являється чорне забарвлення), S. paratyphi Aсірководень не продукують.

S. typhiрозкладають глюкозу без газоутворення, лактозонегативні, продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика без розривів, скошена частина не змінює колір і залишається малиновою, під час уколу з'являється чорне забарвлення.

Shigella spp.глюкозопозитивні, лактозонегативні, не продукують сірководень. Вони викликають пожовтіння стовпчика (з розривами або без них залежно від сировара), скошена частина не змінює колір і залишається малиновою.

Б. Остаточна ідентифікація чистої культури(Визначення систематичного положення виділеного мікроорганізму до рівня виду або варіанту) та визначення спектру чутливості виділеної культури до антибіотиків.

Для ідентифікації чистої культури цьому етапі вивчають біохімічні, генетичні, серологічні і біологічні ознаки (табл. 8).

У рутинній лабораторній практиці при ідентифікації не потрібно вивчати всі властивості. Використовують інформаційні, доступні, прості тести, достатні визначення видової (варіантної) приналежності виділеного мікроорганізму.

Бактеріологічне дослідження - це дослідження, призначене для виділення та вивчення їх властивостей з метою встановлення мікробіологічного діагнозу.

Досліджуваний матеріал слід брати в асептичних умовах у стерильний посуд і доставляти до лабораторії якнайшвидше. У разі потреби проби слід зберігати на холоді. Методика взяття проб залежить від об'єкта, характеру захворювання та властивостей мікроорганізму. Одним із найпоширеніших прийомів бактеріологічного дослідження є бактеріоскопія.

Для вивчення нефіксованих бактерій користуються двома методами: розчавленої (між предметним та покривним склом) краплі та . Слід пам'ятати, що препарати нефіксованих бактерій є заразними.

Для бактеріоскопії фіксованих препаратів використовують мазки. Для їх приготування краплю досліджуваної рідини розподіляють поверхнею предметного скла, а потім висушують. Найбільш поширеним методом фіксації препарату є пронесення через полум'я газового пальника. У деяких випадках використовують склади, що фіксують. Фіксовані препарати зазвичай забарвлюють (див. Забарвлення мікроорганізмів). До найважливіших елементів бактеріологічного дослідження відносяться посіви і пересіви, що виробляються бактеріальною петлею або пастерівської піпеткою. Петлю стерилізують прожарюванням в полум'ї, потім її остуджують дотиком до ділянки незасіяного агару або ополіскуючи у стерильній рідині. При використанні пастерівської піпетки її кінчик обламують пінцетом, кілька разів проносять піпетку через полум'я пальника і дають охолонути. При посівах використовують рідкі та тверді живильні середовища. При сівбі на скошений агар культуру бактерій розтирають петлею поверхнею агару. При сівбі в товщу агарового або желатинового стовпчика живильне середовище проколюють до дна пробірки зашморгом або особливою голкою. При сівбі в рідке середовище треба стежити, щоб рідина не виливалася і не змочувала краї пробірок та пробки. Посіви та пересівання слід проводити поблизу полум'я газового пальника, пробірки не повинні довго залишатися відкритими, петля або пастерівська піпетка з культурою не повинна торкатися ні до чого; перед тим як закривати пробірку, краї слід пропалити. Засіяні пробірки необхідно відразу надписати.

Найважливішим етапом бактеріологічного дослідження є ідентифікація - визначення видової чи типової належності бактерій, одержаних у вигляді чистої культури. При ідентифікації бактерій проводиться вивчення їх фізіологічних та біохімічних властивостей, токсиноутворення. Широко використовують серологічні методи ідентифікації бактерій (реакції та). У багатьох випадках ефективним виявляється біологічний метод ідентифікації мікроорганізмів, заснований на зараженні лабораторних тварин матеріалом, що досліджується, або отриманою культурою бактерій і виявленні у тварин характерних патологічних змін.

Для виділення чистих культур використовують механічні та біологічні методи. Приклад механічного методу: краплю досліджуваного матеріалу розтирають тим самим стерильним шпателем або бактеріальною петлею по поверхні щільного живильного середовища, послідовно в першій, другій і третій . Виділення чистої культури проводиться з окремих колоній, що виросли, і полягає в їх дослідженні та відсіві на свіже живильне середовище. Біологічні методи виділення чистих культур засновані на обліку тієї чи іншої властивості мікроба, що виділяється, що відрізняє його від інших мікробів, що знаходяться в досліджуваному матеріалі.

При біологічному методі використовують такого роду живильні середовища, в яких створені умови, сприятливі для розвитку певного виду мікробів. До біологічних методів відноситься також зараження лабораторних тварин, чутливих до виду бактерій, що виділяється.

Бактеріологічне дослідження - комплекс методів виявлення патогенних мікроорганізмів у хворого, у носія чи об'єктах довкілля. Бактеріологічні дослідження користуються також виявлення умовно патогенних і санітарно-показових мікробів, характеризуючих ступінь забруднення довкілля, вивчення мікробного пейзажу певного середовища (об'єкта). Бактеріологічне дослідження може бути використане для діагностики, профілактики інфекційних захворюваньдля санітарно-гігієнічної характеристики середовища, навколишнього людини, для наукового дослідження

Матеріал та метод бактеріологічного дослідження залежать від мети аналізу, умов середовища, патогенезу та перебігу захворювання. За наявності бактеріємії мікроб виявляють за допомогою посіву крові. У випадках виражених місцевих уражень збудника слід шукати у виділеннях або виділеннях ураженого органу (дифтерія, дизентерія, гонорея та ін.). Нарешті, при захворюваннях зі складним перебігом, коли (як, наприклад, при черевному тифі) бактеріємія змінюється ураженнями тонких кишок, на кожному етапі застосовують відповідний метод дослідження: протягом першого тижня захворювання виробляють посів крові, на другий найбільш достовірно серологічне дослідження, починаючи з третього тижня позитивний результат одержують при сівбі випорожнень; останнім методом користуються і як контрольне дослідження для виявлення бактеріоносіїв серед реконвалесцентів і для спостереження за ними.

Виконання будь-якого із зазначених завдань здійснюють застосуванням методів, призначених для виділення та визначення мікроорганізмів. Залежно від характеристики мікроба використовують весь комплекс методів чи його частини.

Бактеріоскопія - найбільш гідний прийом, заснований на мікроскопічному вивченні матеріалу. При мікроскопії свіжих препаратів можна скористатися деякими мікрохімічними реакціями (наприклад, забарвлення йодофільних бактерій розчином Люголя) або вибірковим забарвленням різних структурних частин бактерій.

Більш чітко бактерії можна виявити у забарвленому препараті. Досліджуваний матеріал наносять на предметне скло тонким і наскільки можна рівним шаром. Дають препарату висохнути на повітрі і фіксують одним із загальноприйнятих методів, але найчастіше фламбуванням, тобто дво-, триразовим швидким проведенням препарату над полум'ям пальника так, щоб скло було тепле, але не гаряче. Препарат, остуджений після фіксації, фарбують простим або диференціальним забарвленням (див. Забарвлення мікроорганізмів). При флюоресцентній мікроскопії використовують як нативні, і сухі препарати. У цьому випадку обробка певними барвниками викликає свічення структур мікробного тіла або всього мікроба в ультрафіолетових або коротких синіх променях. В іншій модифікації мікробів обробляють специфічними сироватками, міченими флюоресцентами (барвниками). Бактерії, що відповідають сироватці, світитимуться, оскільки на них осяде мічена сироватка. Гетерологічні бактерії не світитимуться.

Методом бактеріоскопії широко використовують для бактеріологічної діагностики деяких інфекційних захворювань (гонорея, туберкульоз, зворотний тиф), і навіть щодо всього комплексу мікрофлори органу (мигдалини, піхву), продукту чи іншого об'єкта.

Метод посіву, тобто виділення чистої культури шуканого мікроорганізму, є більш точним та надійним способом бактеріологічної діагностики, ніж бактеріоскопія. Свіжий матеріал розмазують поверхнею щільного живильного середовища, налитого в чашки Петрі. Первинний посів виробляють на звичайні середовища, сприятливі для даного мікроба, диференціальні або на селективні середовища. Вибір живильного середовища, як і методу попередньої обробки свіжого матеріалу для посіву, залежить від ступеня його забруднення супутньою сторонньою мікрофлорою. Через 24-48 год. вмісту в термостаті при оптимальній для даного мікроба температурі чашки розглядають і підозрілі колонії пересівають на середовища, що сприяють розмноженню даного збудника. Таким чином отримують культуру однорідних бактерій, які повинні бути ідентифіковані.

Ідентифікація мікроба починається з вивчення його морфології в забарвленому препараті та в розчавленій краплі для визначення форми мікробів та їх рухливості. Наступним етапом є дослідження ферментативної здатності бактерій щодо розщеплення вуглеводів, амінокислот, сечовини у визначених для кожного виду поєднаннях. У бактерій найбільш вивчені цукро- та протеолітичні ферменти.

Ідентифікація мікроба має бути доповнена вивченням інших властивостей, характерних для кожного роду та виду мікроорганізмів. До таких властивостей відноситься здатність вибірково розчиняти еритроцити різних тварин (гемоліз), згортати плазму крові (плазмокоагуляція), розчиняти потік фібрину (фібриноліз) та ін. Всі ці особливості бактерій можуть бути використані при їх визначенні як диференціальні ознаки.

Остаточне визначення мікробів деяких видів, переважно патогенних бактерійсімейства кишкових, що включає серологічну ідентифікацію (див. Ідентифікація мікробів). Зазвичай при цьому ставлять реакцію аглютинації, т. е. виявляють нудьгування бактерій під впливом однойменної імунної сироватки. Аглютинація мікробів у сироватці проти певного виду вказує на приналежність до цього виду. Зазвичай реакцію аглютинації ставлять орієнтовно на склі для остаточного визначення в пробірках з розведеннями сироватки.

Ряд мікробів не вдається визначити до кінця описаним шляхом. Тоді ідентифікацію необхідно доповнити зараження лабораторних тварин, оскільки для деяких бактерій характерна патогенність або токсигенність, що виявляється при зараженні тварин. У деяких випадках зараження тварин є також методом накопичення патогенних мікробів.

Тільки зіставлення всіх показників культури, зібраних щодо морфології, біохімічних, серологічних, а де потрібно і біологічних властивостей її, може дати підстави для ідентифікації. Відповідь при позитивному результаті дослідження не становить труднощів, якщо виділений мікроб типовий. У разі вказують рід, вид і, якщо визначався, тип бактерії. При виділенні мікроба, що відхиляється за якимись властивостями від типової характеристики, дається відповідь із зазначенням на ознаку, що відхиляється. У такому разі корисно повторити дослідження, якщо дозволяє перебіг хвороби або умови збирання матеріалу. Корисно також піддати культуру атипових мікробів додаткового вивчення іншими, складнішими методами.

Негативні результати бактеріологічного дослідження мають відносне значення і лише показують, що у дослідженій порції матеріалу шукані мікроби не містилися чи були нежиттєздатні. Однак вони можуть бути присутніми в іншій порції. Тому, наприклад, при обстеженні на бацилоносійство (черевний тиф, дизентерія, дифтерія) потрібно проводити повторні дослідження.

9971 0

Застосування бактеріологічного методу дає можливість виділити збудника у чистій культурі з матеріалу, отриманого від хворого, та ідентифікувати його на підставі вивчення комплексу властивостей. Більшість бактерій здатні до культивування на різних штучних живильних середовищах (крім хламідій та рикетсій), тому бактеріологічний метод має важливе значення у діагностиці багатьох інфекційних хвороб.

У разі отримання позитивного результату, бактеріологічний метод дозволяє визначити чутливість виділеного збудника до антимікробних препаратів. Проте ефективність зазначеного дослідження залежить від багатьох параметрів, зокрема умов збору матеріалута його транспортуванняу лабораторію.

До основним вимогам, що пред'являються до відбору та транспортування матеріалу для бактеріологічного дослідження, відносять:

• взяття матеріалу на початок етіотропного лікування;
• дотримання умов стерильності при збиранні матеріалу;
• технічну правильність збирання матеріалу;
• достатню кількість матеріалу;
• забезпечення температурного режиму зберігання та транспортування матеріалу;
• зведення до мінімального проміжку часу між збором матеріалу та посівом на щільні живильні середовища.

Транспортування матеріалу в лабораторію має бути здійснено по можливості негайно, але не більше ніж протягом 1-2 годин після його взяття. Проби матеріалу повинні знаходитися за певного температурного режиму; зокрема, стерильні в нормі матеріали (кров, спинномозкова рідина) зберігають та доставляють до лабораторії при 37 °С. Нестерильні матеріали (сеча, що відокремлюється) дихальних шляхівта ін) зберігають при кімнатній температурі не більше 1-2 годин або не більше доби при 4 ° С (умови побутового холодильника). У разі неможливості доставки проб до лабораторії в регламентовані терміни рекомендують використовувати транспортні середовища, призначені для збереження життєздатності збудників в умовах консервації.

Кров для дослідженняслід брати у хворого під час підйому температури тіла, на початку появи лихоманки. Рекомендується дослідити 3-4 проби крові, взяті з інтервалом 4-6 год, що обґрунтовано з точки зору зниження ризику «упустити» транзиторну бактеріємію та підвищення можливості підтвердити етіологічну роль виділеної з крові умовно-патогенної мікрофлори, якщо ця мікрофлора виявляється у кількох пробах венозної крові. Пробу крові у кількості 10 мл у дорослого та 5 мл у дітей засівають мінімум у два флакони з середовищем для аеробних та анаеробних мікроорганізмів у співвідношенні 1:10. Бажано одноразове дослідження та артеріальної крові.

Взяття спинномозкової рідини(СМР) виробляє лікар при люмбальної пункціїу кількості 1-2 мл у суху стерильну пробірку. Пробу негайно доставляють до лабораторії, де її дослідження приступають також негайно. За відсутності такої можливості матеріал зберігається за 37 °С протягом декількох годин. Істотно підвищує кількість позитивних результатів бактеріологічного дослідження посів 1-2 крапель СМР в пробірку, що містить напіврідке середовище з глюкозою, і чашку Петрі з «кров'яним» агаром. Для пересилання матеріалу використовують ізотермальні ящики, грілки, термоси або будь-яку іншу упаковку, де температура підтримується близько 37 °С.

Випорожненнядля бактеріологічного дослідження відбирають за допомогою стерильних дерев'яних шпателів у кількості 3-5 г в стерильний посудину з кришкою, що щільно закривається. Дослідження взятого матеріалу повинно бути розпочато не пізніше ніж через 2 години. Якщо неможливо розпочати дослідження протягом цього часу, слід відібрати невелику кількість матеріалу, який поміщають у відповідне транспортне середовище. При відборі випорожнень слід прагнути спрямовувати для дослідження патологічні домішки (слиз, гній, частинки епітелію та ін.), якщо вони є, уникаючи потрапляння в матеріал домішки крові, що має бактерицидні властивості.

Для взяття матеріалу можуть бути використані ректальні тампони (з ватним наконечником). Тампон повинен бути зволожений стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію або транспортним середовищем (але не масляним гелем). Його вводять per rectum на глибину 5-6 см і, повертаючи тампон, обережно витягають його, контролюючи появу на тампоні фекального забарвлення. Тампон поміщають у суху пробірку, якщо дослідження матеріалу приступлять протягом 2 год, в іншому випадку - в транспортне середовище.

Мочу(середня порція вільно випущеної сечі) у кількості 3-5 мл збирають у стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Переважно відбирати ранкові порції сечі.

Жовчзбирають під час дуоденального зондування в процедурному кабінеті окремо за порціями А, В і С три стерильні пробірки, дотримуючись правил асептики.

Промивні води шлунказбирають у стерильні банки у кількості 20-50 мл. Слід мати на увазі, що промивання шлунка в цих випадках проводять тільки індиферентними (не мають бактеріостатичну або бактерицидну дію на мікроорганізми) розчинами - краще кип'яченою водою(без додавання соди, перманганату калію та ін.).

Мокрота. Ранкове мокротиння, що виділяється під час нападу кашлю, збирають у стерильну банку. Перед відкашлюванням хворий чистить зуби та полоще рот кип'яченою водою з метою механічного видалення залишків їжі, злущеного епітелію та мікрофлори ротової порожнини.

Промивні води бронхів. При бронхоскопії вводять не більше 5 мл ізотонічного розчину хлориду натрію з подальшим його відсмоктуванням в стерильну пробірку.

Відокремлюване глотки, ротової порожнини та носа. Матеріал з ротової порожнини беруть натще або через 2 години після їжі стерильним ватним тампоном або ложечкою зі слизової оболонки та її уражених ділянок біля входів проток слинних залоз, поверхні язика, з виразок. За наявності плівки останню знімають стерильним пінцетом. Матеріал із носової порожнини забирають сухим стерильним ватним тампоном, який вводять у глибину порожнини носа. Матеріал із носоглотки беруть стерильним задньоглоточним ватним тампоном, який обережно вводять через носовий отвір у носоглотку. Якщо при цьому починається кашель, тампон не видаляють до закінчення кашлю. Для проведення аналізу на дифтерію досліджують одночасно плівки та слиз з носа та глотки, беручи матеріал різними тампонами.

Досліджуваний матеріал засівають на щільні живильні середовища, використовуючи спеціальні методики для отримання зростання окремих колоній мікроорганізмів, які відсівають далі з метою виділення чистої культури збудника.

Певні види бактерій виділяють, використовуючи елективні (виборчі) середовища, які затримують зростання сторонніх мікроорганізмів або містять речовини, що стимулюють зростання певних патогенних мікробів.

Виділені на живильних середовищах мікроорганізми ідентифікують, тобто. визначають видову чи типову їх приналежність. У останнім часомДля ідентифікації у практиці охорони здоров'я використовують мікротест-системи, що є панелі з набором диференціально-діагностичних середовищ, що прискорює дослідження. Мікротест-системи застосовують і для визначення чутливості мікроорганізмів до антимікробних препаратів методом розведення антибіотика в рідкому живильному середовищі.

Оцінюючи результати бактеріологічного дослідження, лікар повинен враховувати, що негативний результат не завжди означає відсутність збудника та може бути пов'язаний із застосуванням антимікробних препаратів, високою мікроцидною активністю крові, технічними похибками. Виявлення патогенного мікроба в матеріалі від хворого поза зв'язком з клінічною картиноюможливо у разі реконвалесцентного, здорового чи транзиторного бактеріоносійства.

Виділення з крові за дотримання всіх правил асептики умовно-патогенних мікроорганізмів (епідермальний стафілокок, кишкова паличка) і навіть сапрофітів слід вважати проявом бактеріємії, особливо якщо ці мікроби виявлені більше ніж в одній пробі матеріалу або в різних субстратах (кров, сеча), оскільки при зниження імунореактивності організму ці та інші «непатогенні» мікроорганізми можуть бути збудниками інфекційних процесів, у тому числі і сепсису.

Певну складність представляє трактування результатів бактеріологічного дослідження нестерильних середовищ, А саме доказ етіологічної ролі умовно-патогенних мікроорганізмів У цьому випадку враховують у комплексі такі показники, як вид виділених культур, кількість мікробних клітин даного виду в матеріалі, повторне виділення їх протягом захворювання, присутність монокультури або асоціації мікроорганізму.

Ющук Н.Д., Венгер Ю.Я.