Інсулін: що це таке та які його типи існують? З чого роблять інсулін для діабетиків: сучасне виробництво та методи отримання Інсулін із чого роблять.

Сучасне біотехнологічне виробництво інсуліну є складним процесом, заснованим на генетичній зміні мікроорганізмів. Цей метод порівняно новий та впроваджений у виробництво у вісімдесяті роки минулого сторіччя. З його допомогою отримують препарат, що повністю відповідає тому, що виробляється в організмі людини. Звідси й назва "людський інсулін".

Слід зазначити, що цей термін «людський інсулін» іноді викликає дещо невірні реакції та припущення, що лікарський препарат одержують із організму людини. Саме з цієї причини так часто ставить питання: «Як виробляють інсулін?» - і звідки виникло таке визначення.

Справді, донедавна технологія виробництва інсуліну була зовсім іншою. Його витягали з організму свиней чи великої рогатої худоби і називали відповідно, наприклад, свинячим чи бичачим. Однак, ця технологія виробництва застаріла і має низку серйозних недоліків, серед яких перше місце займає неможливість отримання чистої речовини без домішок проінсуліну, що викликає у людини різні алергічні реакції та вироблення антитіл.

До того ж у зв'язку з постійним зростанням кількості хворих на цукровий діабет, тваринної сировини для виробництва інсуліну не вистачає, що стало ще одним поштовхом для пошуку сучасних нових методик його отримання штучним шляхом.

На сьогоднішній день людський або рекомбінований препарат одержують із штамів дріжджів чи кишкової палички. Ці речовини обрані невипадково: під час свого зростання живильному середовищі вони виробляють дуже багато необхідного гормону. Це означає, що процес має не лише технологічний характер, а й біологічний, адже потрібна речовина виробляється живими організмами, а потім перетворюється, а не синтезується хімічним шляхом.

Слід зазначити, що наука пройшла складний і важкий шлях, перш ніж було знайдено та впроваджено у виробництво біотехнологічний спосіб отримання ліків для діабетиків. Вперше точний склад інсуліну, що виробляється людиною, було встановлено у шістдесяті роки минулого сторіччя. З'ясувалося, що його молекули мають інший склад амінокислоти, відмінний від амінокислоти тваринного походження. Пізніше були спроби заміни однієї амінокислоти на іншу, до речі, цілком успішні, але дуже дорогі. Цей метод було визнано нерентабельним і безперспективним у нашій країні, а й там.

І лише через два десятиліття наполегливої ​​праці вдалося отримати абсолютно чистий препарат, що повністю відповідає тому, що виробляється в організмі здорової людини, що не викликає відторгнення та алергічних реакцій.

Виробництво людського інсуліну засноване на методі генної інженерії, в ході якого в молекулу ДНК дріжджів вбудовується ген, що визначає вироблення гормону, повністю схожого на те, що виробляється людиною. Цей метод широко використовується у всіх розвинених країнах світу та дозволяє отримувати препарати для лікування діабету чудової якості та у потрібній кількості.

Власне виробництво інсуліну у Росії планується найближчим часом. Вже ведеться будівництво цеху на Уралі. Проте наразі препарати для лікування хворих на цукровий діабет закуповуються за кордоном, на що витрачаються величезні суми з бюджету країни.

Слід зазначити, що технологія його виробництва вже випробувана у Росії досвідченим шляхом і при цьому отримані чудові результати. Наші, вітчизняні препаративиявилися більш ефективними та чистими. Залишилося лише налагодити виробничий процес.

Відгуки та коментарі

Залишити відгук або коментар

Не менш корисні матеріали на тему:

Форма випуску

Інсулін - це лікарський препарат, що має здатність знижувати рівень глюкози, при його відхиленні від норми, та регулювати процес засвоєння вуглеводів організмом. Він незамінний при лікуванні діабету, а при правильно підібраній дозі та своєчасно розпочатій терапії дозволяє хворим людям вести повноцінне життя.

Катриджі

Інсулін у картриджах призначений для введення за допомогою так званих шприців-ручок, що отримали свою назву завдяки зовнішній схожості з автоматичною пір'яною ручкою. Шприц ручка дозволяє дозувати кількість препарату, що вводиться, що значною мірою спрощує життя хворих на цукровий діабет. При цьому не потрібно...

В ампулах

Інсулін це гормон підшлункової залози. Для виробництва лікарських препаратівна його основі використовують органи тварин, а також біотехнології, що дозволяють одержувати речовини, аналогічні гормонам людини. Характерною особливістю інсуліну є його нестійкість до впливу ферментів, що містяться в травному тракті. Це означає, що інсулінові...

Таблетки замість інсуліну

Інсулін – це гормон. Він виробляється у здоровій підшлунковій залозі. Діабет виникає в тому випадку, якщо підшлункова залоза хвора або просто не справляється зі своїми функціями. На сьогоднішній день лікування діабету засноване на введенні в організм хворого гормону, отриманого штучним...

Хто винайшов інсулін?

Відкриття інсуліну відбулося 1922 року. Саме тоді тяжко хворому на цукровий діабет хлопчику було введено препарат, отриманий із підшлункової залози бика. В результаті вдалося не тільки врятувати життя, а й зупинити прогресуючу недугу. У самій історії інсуліну не обійшлося без чудес.

Формула та структура інсуліну

Будова інсуліну цікавила вчених з його відкриття. Численні досліди у цьому напрямі було розпочато ще його першовідкривачами Фредеріком Бантінгом та Чарльзом Бестом. У цьому вчені намагалися встановити точну хімічну формулу виділеного гормону, що дозволило синтезувати його хімічним шляхом. Забігаючи...

Інсулін є регулятором вуглеводного обміну. В людини інсулін синтезується в бетаклетках острівців Лангерганса підшлункової залози. За відсутності чи нестачі його синтезу розвивається таке захворювання як цукровий діабет (інсулінозалежний діабет – 1 типу). При цукровому діабеті підвищується вміст глюкози у крові та розвиваються патологічні процеси. Діабет II типу (інсулінозалежний) виникає при дефектах у структурі рецепторів, які відповідають за проникнення глюкози в клітину. Всі ці відомості стосуються етіології такого захворювання, як цукровий діабет.

Інсулін це пептидний гормон, що складається з двох пептидних ланцюгів: А-ланцюг складається з 21 амінокислотних залишків. В-ланцюг складається з 30 амінокислотних залишків. Ці два ланцюги пов'язані бісульфідними SS зв'язками, які забезпечують просторову структуру інсуліну білка. p align="justify"> При синтезі інсуліну в підшлунковій залозі спочатку утворюється попередник інсуліну, так званий проінсулін. Цей проінсулін складається з А-ланцюга, В-ланцюга та С-пептиду, що складається з 35 амінокислотних залишків. С-пептид відщеплюється під дією карбоксипептидази та трипсину та проінсулін переходить в активний інсулін.

Існують різні способи отримання інсуліну. Ми зупинимося на отриманні інсуліну біосинтетичним шляхом з погляду переваги цього методу.

До отримання рекомбінантного інсуліну препарат отримували із підшлункової залози свиней та великої рогатої худоби. Однак такий спосіб отримання інсуліну мав цілу низку недоліків:

− нестача поголів'я худоби;

− складності зберігання та транспортування сировини;

− труднощі виділення та очищення гормону;

− можливість розвитку алергічних реакцій.

Такий інсулін, як чужорідний білок, також може інактивуватися в крові утворюються антитілами. Крім того, для отримання 1 кг інсуліну потрібно 35 тисяч голів свиней (якщо відомо, що річна потреба в інсуліні -1 тонна препарату). З іншого боку, біосинтетичним шляхом можна отримати таку ж кількість інсуліну, провівши біосинтез у 25 кубовому ферментері, використовуючи рекомбінантний мікроорганізм Escherichia coli. Біосинтетичний метод отримання інсуліну став застосовуватися на початку 80-х.

Нині інсулін людини, переважно, отримують двома способами:

1) модифікацією свинячого інсуліну синтетико-ферментативним методом;

Метод заснований на тому, що свинячий інсулін відрізняється від інсуліну людини однією заміною на С-кінці В-ланцюга Ala30Thr. Заміну аланіну на треонін здійснюють шляхом каталізованого ферментом відщеплення аланіну і приєднання замість нього захищеного по карбоксильній групі залишку треоніну, присутнього в реакційній суміші у надлишку. Після відщеплення захисної О-трет-бутильної групи одержують інсулін людини.

2) генно-інженерним способом;

Існує два основні підходи для отримання генно-інженерного інсуліну людини.

У першому випадку (2.1) здійснюють роздільне (різні штами-продуценти) отримання обох ланцюгів з наступним фолдинг молекули (утворення дисульфідних містків) і поділом ізоформ.

У другому (2.2) - отримання у вигляді попередника (проінсуліну) з подальшим ферментативним розщепленням трипсином та карбоксипептидазою до активної форми гормону.

Найбільш переважним в даний час є одержання інсуліну у вигляді попередника, що забезпечує правильність замикання дисульфідних містків (у разі роздільного одержання ланцюгів проводять послідовні цикли денатурації, поділу ізоформ та ренатурації).

Метод 2.1. Роздільний синтез А- і В-ланцюгів з подальшим укладанням між ними дисульфідних зв'язків

1. Шляхом хімічного синтезустворюються послідовності нуклеотидів, які кодують утворення А та В ланцюгів (створення синтетичних генів).

2. Кожен із синтетичних генів вводять у плазміди (в одну плазміду вводять ген, що синтезує ланцюг А, в іншу плазміду вводять ген, який синтезує ланцюг В).

3. Вводять ген, що кодує утворення ферменту бетагалактозідази. Цей ген включають у кожну плазміду для того, щоб досягти активної реплікації плазмід.

4. Плазміди вводять в клітину E. coli-кишкової палички і отримують дві культури продуцента, одна культура синтезує А-ланцюг, друга В-ланцюг.

5. Поміщають дві культури ферментер. У середу додають галактозу, що індукує утворення ферменту бетагалактозидази. При цьому плазміди активно реплікуються, утворюючи багато копій плазмід і, отже, багато генів, що синтезують А і ланцюга.

6. Клітини лізують, виділяють А та В ланцюги, які пов'язані з бетагалактозидазою. Все це обробляють бромціаном і відщеплюють А та В-ланцюги від бетагалактозидази. Потім проводять подальше очищення та виділення А та В ланцюгів.

7. Окислюють залишки цистеїну, зв'язують та одержують інсулін.

Недоліки подібного методу: треба отримувати два окремі штами-продуценти, проводити дві ферментації, дві процедури виділення та очищення, а найголовніше, важко забезпечити правильне замикання дисульфідних зв'язків, тобто отримати активний інсулін.

Метод 2.2. Синтез проінсуліну з подальшим вищепленням С-пептиду.

При цьому конформація проінсуліну забезпечує правильне замикання дисульфідних зв'язків, що робить другий спосіб мікробіологічного синтезу перспективнішим.

В Інституті біоорганічної хімії РАН отримано рекомбінантний інсулін (інсуран) з використанням генно-інженерних штамів E.coli. З вирощеної біомаси виділяється попередник, гібридний білок, що експресується у кількості 40% від усього клітинного білка, що містить препроінсулін. Перетворення його в інсулін in vitro здійснюється в тій же послідовності, що і in vivо - відщеплюється лідируючий поліпептид, препроінсулін перетворюється на інсулін через стадії окисного сульфітолізу з подальшим відновним замиканням трьох дисульфідних зв'язків і ферментативним вичлененням зв'язуючого. Після низки хромотографічних очищень, що включають іонообмінні, гелеві та ВЕРХ, одержують людський інсулін високої чистоти та природної активності.

На відміну від інсуліну амінокислотна послідовність с-пептиду сильно відрізняється у різних видів ссавців, що унеможливлює отримання його з тваринної сировини. Існуючі способи отримання пептиду, можна розділити на три категорії:

1) Отримання с-пептиду хімічним синтезом. Цим способом отримано більшість препарату, представленого на ринку нині.

2) Отримання с-пептиду біосинтетичними методами у складі злитих білків. Для отримання пептиду цим способом створюється химерний білок, в якому за лідерним фрагментом слідують кілька послідовностей пептиду, розділених амінокислотами, що забезпечують гідроліз специфічними протеазами. У першому етапі відбувається культивування мікроорганізмів у ферментерах, потім у яких індукується синтез рекомбінантного поліпептиду; клітини руйнуються, і рекомбінантний білок очищається та обробляється специфічними протеазами, що призводять до отримання пептиду. На заключному етапі відбувається очищення пептиду від домішок. Цей спосіб може забезпечити великі обсяги виробництва, але вимагає створення штамів-продуцентів, відпрацювання умов культивування мікроорганізмів, способів очищення рекомбінантного білка, а також створення та валідації методів контролю якості.

3) Отримання с-пептиду біосинтетичними методами спільно з інсуліном. Цей спосіб виробництва полягає у введенні деяких модифікацій в технологію отримання рекомбінантного інсуліну з метою оптимізації отримання пептиду, що утворюється на певних етапах виробництва, в основі якого лежить отримання проінсуліну, що не піддається модифікаціям. Цей спосіб має ряд переваг. Для отримання пептиду цим способом не потрібно створення нових штамів-продуцентів, відпрацювання технології очищення та згортання білка, створення нових інструментальних методівконтролю виробничого процесу

Інсулін – це гормон, який грає найважливішу роль забезпечення нормального функціонування організму людини. Він виробляється клітинами підшлункової залози та сприяє засвоєнню глюкози, яка є головним джерелом енергії та основним харчуванням для мозку.

Але іноді через ті чи інші причини секреція інсуліну в організмі помітно знижується або припиняється зовсім, як при цьому бути і чим допомогти. Це призводить до тяжкого порушення вуглеводного обміну та розвитку такого небезпечного захворювання, як цукровий діабет.

Без своєчасного та адекватного лікування ця хвороба може призвести до серйозних наслідків, аж до втрати зору та кінцівок. Єдиним способом недопущення розвитку ускладнень є регулярні ін'єкції штучно отриманого інсуліну.

Але з чого роблять інсулін для діабетиків та як він впливає на організм хворого? Ці питання цікавить багатьох людей із діагнозом цукровий діабет. Щоб розібратися, необхідно розглянути всі методи отримання інсуліну.

Різновиди

Сучасні препарати інсуліну розрізняються за такими ознаками:

• Джерелу походження;
• Тривалість дії;
• pH розчину (кислі чи нейтральні);
• Присутністю у складі консервантів (фенол, крезол, фенол-крезол, метилпарабен);
• Концентрацією інсуліну – 40, 80, 100, 200, 500 ОД/мл.

Дані ознаки впливають на якість препарату, його вартість та ступінь впливу на організм.

Джерела

Рівень цукру

Залежно від джерела отримання препарати інсуліну поділяються на дві основні групи:

Тварини. Їх одержують із підшлункових залоз великої рогатої худоби та свиней. Вони можуть бути небезпечними, оскільки часто викликають серйозні алергічні реакції. Особливо це стосується бичачого інсуліну, який містить три амінокислоти нехарактерні для людського. Свинячий інсулін більш безпечний, тому що відрізняється лише на одну амінокислоту. Тому він частіше застосовується у лікуванні цукрового діабету.

Людські. Вони бувають двох видів: аналогічні людським або напівсинтетичні, одержувані зі свинячого інсуліну шляхом ферментативної трансформації та людські або ДНК-рекомбінантні, які виробляють бактерії кишкової палички завдяки досягненням генної інженерії. Ці препарати інсуліну абсолютно ідентичні гормону, що виробляється підшлунковою залозою людини.

Сьогодні лікування цукрового діабету широко застосовується інсулін як людського, і тваринного походження. Сучасне виробництво тварин інсулінів передбачає найвищий ступінь очищення препарату.

Це допомагає позбавити його таких небажаних домішок, як проінсулін, глюкагон, соматостатин, білки, поліпептиди, які здатні викликати серйозні побічні дії.

Найкращим препаратом тваринного походження вважається сучасний монопіковий інсулін, тобто вироблений із виділенням «піка» інсуліну.

Тривалість дії

Виробництво інсулінів виконується за різними технологіями, що дозволяє отримати препарати різної тривалості дії, а саме:

• ультракороткої дії;
• короткої дії;
• пролонгованої дії;
• середньої тривалості дії;
• тривалої дії;
• комбінованої дії.

Інсуліни ультракороткої дії. Дані препарати інсуліну відрізняються тим, що починають діяти відразу після ін'єкції і досягають піку вже через 60-90 хвилин. Їхній загальний час дії становить не більше 3-4 годин.

Існує два основні види інсуліну з ультракороткою дією – це Лізпро та Аспарт. Отримання інсуліну Лізпро виконується шляхом перестановки у молекулі гормону двох амінокислотних залишків, а саме лізину та проліну.

Завдяки подібній модифікації молекули вдається уникнути утворення гексамерів і прискорити його розпад на мономери, а значить покращити засвоєння інсуліну. Це дозволяє отримати інсуліновий препарат, який надходить у кров хворого втричі швидше за природний людський інсулін.

Іншим інсуліном ультракороткої дії є Аспарт. Способи отримання інсуліну Аспарта багато в чому схожі на виробництво Лізпро, тільки в цьому випадку пролін замінюється на негативно заряджену аспарагінову кислоту.

Як і Лізпро, Аспарт швидко розпадається на мономери і тому майже миттєво вбирається в кров. Всі препарати інсуліну з ультракороткою дією дозволяється вводити прямо перед їжею або одразу після її прийому.

Інсуліни короткої дії. Ці інсуліни є буферні розчини з нейтральним pH (від 6,6 до 8,0). Їх рекомендується вводити як , але у разі потреби дозволяється використовувати внутрішньом'язові ін'єкції або крапельниці.

Ці інсулінові препарати починають діяти вже через 20 хвилин після потрапляння в організм. Їхня дія триває відносно недовго – не більше 6 годин, і досягає свого максимуму через 2 години.

Інсуліни короткої дії в основному виробляють для лікування хворих на цукровий діабет в умовах стаціонару. Вони ефективно допомагають пацієнтам з діабетичною комою та прикомою. Крім того, вони дозволяють найточніше визначити необхідну дозу інсуліну для хворого.

Інсуліни середньої тривалості дії. Ці препарати розчиняються набагато гірше, ніж інсуліни короткої дії. Тому вони повільніше надходять кров, що помітно збільшує їхню гіпоглікемічну дію.

Одержання інсуліну середньої тривалості дії досягається шляхом введення в їх склад особливого пролонгатора - цинку або протаміну (ізофан, протафан, базал).

Такі інсулінові препарати випускаються у вигляді суспензій, з певною кількістю кристалів цинку або протаміну (найчастіше протаміну Хагедорну та ізофана). Пролонгатори значно збільшують час всмоктування препарату з підшкірної клітковини, що збільшує час надходження інсуліну в кров.

Інсуліни тривалої дії. Це найбільш сучасний інсулін, отримання якого стало можливим завдяки розвитку ДНК-рекомбінантної технології. Найпершим інсуліновим препаратом тривало дії став Гларгін, який є точним аналогом гормону, що виробляється підшлунковою залозою людини.

Для його отримання проводиться складна модифікація молекули інсуліну, що передбачає заміну аспарагіну на гліцин та подальше приєднання двох залишків аргініну.

Гларгін випускається у вигляді прозорого розчину з характерним для нього кислим рН 4. Такий рН дозволяє зробити гексамери інсуліну більш стійкими і тим самим забезпечити тривале та передбачуване всмоктування препарату у кров хворого. Однак через кислий рН Гларгін не рекомендується комбінувати з інсулінами короткої дії, які зазвичай мають нейтральний рН.

Більшість інсулінових препаратів мають так званий пік дії, при досягненні якого в крові пацієнта спостерігається найбільша концентрація інсуліну. Проте головна особливість Гларгіна у тому, що він немає явного піку дії.

Усього однієї ін'єкції препарату на день достатньо для забезпечення хворому надійного безпікового глікемічного контролю на наступні 24 години. Це досягається завдяки тому, що Гларгін всмоктується з підшкірної клітковини з однаковою швидкістю протягом усього періоду дії.

Інсулінові препарати тривалої дії виробляються у різних формах і можуть забезпечити хворому на гіпоглікемічний ефект до 36 годин поспіль. Це допомагає значно знизити кількість ін'єкцій інсуліну на день і тим самим помітно полегшити життя хворих на діабет.

Комбіновані препарати. Ці препарати випускаються у формі суспензії до складу якої входить нейтральний розчин інсуліну з короткою дією та інсуліни середньої дії з ізофаном.

Такі препарати дозволяють хворому вводити до свого організму інсуліни різної тривалості дії з допомогою лише однієї ін'єкції, отже уникнути додаткових уколів.

Знезараження препаратів інсуліну має велике значення для безпеки хворого, тому що вони вводяться в його організм ін'єкційно і з кровотоком розносяться по всьому. внутрішнім органамта тканин.

Певну бактерицидну дію мають деякі речовини, які додаються до складу інсуліну не тільки як знезаражуючий засіб, а й як консерванти. До них відноситься крезол, фенол та метилпарабензоат. Крім того, виражена антимікробна дія також характерна для іонів цинку, які входять до складу деяких інсулінових розчинів.

Багаторівневий захист від бактеріальної інфекції, Що досягається шляхом додавання консервантів та інших антисептичних засобів, дозволяє попередити розвиток багатьох важких ускладнень. Адже багаторазове введення голки шприца у флакон з інсуліном могло стати причиною зараження препарату хвороботворними бактеріями.

Однак бактерицидні властивості розчину допомагають знищити шкідливі мікроорганізми та зберегти його безпеку для пацієнта. З цієї причини хворі на цукровий діабет можуть використовувати один і той же шприц для виконання підшкірних ін'єкцій інсуліну до 7 разів поспіль.

Ще одна перевага наявності консервантів у складі інсуліну – відсутність необхідності знезаражувати шкіру перед уколом. Але це можливо лише за допомогою спеціальних інсулінових шприців, оснащених дуже тонкою голкою.

Необхідно підкреслити, що присутність консервантів в інсуліні не впливає на властивості препарату і абсолютно безпечна для хворого.

Висновок

На сьогоднішній день інсулін, що отримується як з використанням підшлункових залоз тварин, так і сучасних методівгенної інженерії, широко застосовується до створення великої кількості препаратів.

Найбільш переважними для щоденної інсулінотерапії є високоочищені ДНК-рекомбінантні людські інсуліни, які відрізняються найнижчою антигенністю, а отже, практично не викликають алергічних реакцій. Крім того, високу якість і безпеку мають препарати, створені на основі аналогів людського інсуліну.

Інсулінові препарати реалізуються у скляних флаконах різної ємності, герметично закритих гумовими пробками та покритих обкаткою з алюмінію. Крім цього, їх можна придбати у спеціальних інсулінових шприцах, а також шприц-ручках, які особливо зручні для дітей.

В даний час розробляються принципово нові форми інсулінових препаратів, які вводяться в організм інтраназальним способом, тобто через слизову оболонку носа.

Як було встановлено, поєднуючи інсулін з детергентом, можна створити аерозольний препарат, який досягав би необхідної концентрації в крові хворого так само швидко, як і при внутрішньовенній ін'єкції. Крім того, створюються нові пероральні інсулінові препарати, які можна буде приймати через рот.

На сьогоднішній день ці види інсулінів поки що знаходяться або на стадії розробки, або проходять необхідні клінічні тести. Однак цілком очевидно, що незабаром з'являться препарати інсуліну, які не потрібно буде вводити за допомогою шприців.

Нові інсулінові засоби будуть випускатися у вигляді спреїв, якими необхідно буде просто бризнути на слизову поверхню носа або рота, щоб задовольнити потребу організму в інсуліні.

Інсулін – це основні ліки для лікування хворих на цукровий діабет 1 типу. Іноді він також використовується для стабілізації стану пацієнта та покращення його самопочуття при другому типі захворювання. Ця речовина за своєю природою є гормоном, який здатний у малих дозах впливати на обмін вуглеводів.

У нормі підшлункова залоза виробляє достатньо інсуліну, який допомагає підтримувати фізіологічний рівень цукру в крові. Але за серйозних ендокринних порушень єдиним шансом допомогти хворому часто стають саме ін'єкції інсуліну. Приймати його перорально (у вигляді таблеток), на жаль, не можна, оскільки він повністю руйнується в травному тракті та втрачає біологічну цінність.

Варіанти отримання інсуліну для використання у медичній практиці

Багато діабетиків напевно хоч раз задавалися питанням, з чого роблять інсулін, який застосовується в медичних цілях? В даний час найчастіше ці ліки отримують за допомогою методів генної інженерії та біотехнології, але іноді його витягують із сировини тваринного походження.

Препарати, які одержують із сировини тваринного походження

Отримання цього гормону з підшлункової залози свиней та великої рогатої худоби – стара технологія, яка сьогодні використовується досить рідко. Це пов'язано з невисокою якістю одержуваних ліків, його схильністю викликати алергічні реакції та недостатнім ступенем очищення. Справа в тому, що оскільки гормон - це білкова речовина, воно складається з певного набору амінокислот.

Інсулін, що виробляється в організмі свині, відрізняється за амінокислотним складом від інсуліну людини на 1 амінокислоту, а інсулін бика - на 3.

На початку та середині 20 століття, коли аналогічних препаратівне існувало, навіть такий інсулін став проривом у медицині та дозволив вивести лікування діабетиків на новий рівень. Гормони, отримані таким методом, знижували цукор крові, щоправда, вони часто викликали побічні ефектита алергію. Відмінності у складі амінокислот та домішки в ліках позначалися на стані пацієнтів, особливо це виявлялося у більш вразливих категорій хворих (дітей та людей похилого віку). Ще одна причина поганої переносимості такого інсуліну - наявність його неактивного попередника в ліки (проінсуліну), позбутися якого в даній варіації ліки було неможливо.

Нині існують удосконалені свинячі інсуліни, які позбавлені цих недоліків. Їх отримують з підшлункової залози свині, але після цього піддають додаткової обробки та очищення. Вони є багатокомпонентними та містять у своєму складі допоміжні речовини.

Модифікований свинячий інсулін практично нічим не відрізняється від людського гормону, тому його досі використовують на практиці

Такі ліки переносяться пацієнтами набагато краще і практично не викликають побічних реакцій, вони не пригнічують імунітет та ефективно знижують цукор у крові. Бичачий інсулін на сьогоднішній день у медицині не використовується, тому що через свою чужорідну структуру він негативно впливає на імунну та інші системи організму людини.

Генноінженерний інсулін

Людський інсулін, який застосовується для діабетиків, промисловому масштабіодержують двома способами:

• за допомогою ферментативної обробки свинячого інсуліну;
• з використанням генномодифікованих штамів кишкової палички чи дріжджів.

При фізико-хімічному зміні молекули свинячого інсуліну під впливом спеціальних ферментів стають ідентичними інсуліну людини. Амінокислотний склад одержаного препарату нічим не відрізняється від складу натурального гормону, що виробляється в організмі людей. У процесі виробництва ліки проходять високу очистку, тому не викликають алергічних реакцій та інших небажаних проявів.

Але найчастіше інсулін одержують за допомогою модифікованих (генетично змінених) мікроорганізмів. Бактерії або дріжджі за допомогою біотехнологічних методів змінені таким чином, що можуть виробляти самі інсулін.

Крім отримання інсуліну, важливу роль відіграє його очищення. Щоб препарат не викликав жодних алергічних та запальних реакцій, на кожній стадії необхідно стежити за чистотою штамів мікроорганізмів та всіх розчинів, а також інгредієнтів, що використовуються.

Існує 2 методики подібного одержання інсуліну. Перша їх заснована на використанні двох різних штамів (видів) якогось одного мікроорганізму. Кожен із них синтезує лише один ланцюг молекули ДНК гормону (всього їх дві, і вони спірально закручені між собою). Потім ці ланцюги з'єднуються, і в отриманому розчині можна відокремити активні форми інсуліну від тих, які не несуть ніякого біологічного значення.

Другий спосіб одержання ліків за допомогою кишкової палички або дріжджів ґрунтується на тому, що мікроб спочатку виробляє неактивний інсулін (тобто його попередник – проінсулін). Потім за допомогою ферментативної обробки цю форму активують та використовують у медицині.

Персонал, який має доступ до певних виробничих приміщень, завжди має бути одягнений у стерильний захисний костюм, завдяки чому контакт препарату з біологічними рідинами людини виключається.

Всі ці процеси зазвичай автоматизовані, повітря і всі поверхні, що стикаються з ампулами і флаконами, стерильні, а лінії з обладнанням герметично закриті.

Методи біотехнології дають змогу вченим думати про альтернативні рішення проблеми цукрового діабету. Наприклад, на сьогоднішній день проводяться доклінічні дослідження виробництва штучних бета-клітин підшлункової залози, які можуть бути одержані за допомогою методів генної інженерії. Можливо, у майбутньому їх використовуватимуть для покращення функціонування цього органу у хворої людини.

Виробництво сучасних препаратів інсуліну – складний технологічний процес, який передбачає автоматизацію та мінімальне втручання людини

Додаткові компоненти

Виробництво інсуліну без допоміжних речовин сучасному світіпрактично неможливо уявити, адже вони дозволяють покращити його хімічні властивості, продовжити час дії та досягти високого ступеня чистоти.

За своїми властивостями всі додаткові інгредієнти можна поділити на такі класи:

• пролонгатори (речовини, що використовуються для забезпечення більш тривалої дії ліків);
• дезінфекційні компоненти;
• стабілізатори, завдяки яким у розчині ліків підтримується оптимальна кислотність.

Пролонгуючі добавки

Існують інсуліни продовженої дії, біологічна активність яких продовжується протягом 8 – 42 годин (залежно від групи препарату). Такий ефект досягається завдяки додаванню в ін'єкційний розчин спеціальних речовин – пролонгаторів. Найчастіше з цією метою застосовується одна з таких сполук:

• білки;
• хлористі солі цинку.

Білки, які продовжують дію ліків, проходять детальне очищення та є низькоалергенними (наприклад, протамін). Солі цинку також негативно впливають ні на активність інсуліну, ні на самопочуття людини.

Антимікробні складові

Дезінфектори у складі інсуліну необхідні для того, щоб при зберіганні та використанні в ньому не розмножувалася мікробна флора. Ці речовини є консервантами та забезпечують збереження біологічної активності ліків. До того ж, якщо пацієнт вводить гормон із одного флакона лише самому собі, то ліки йому може вистачити на кілька днів. За рахунок якісних антибактеріальних компонентів у нього не буде потреби викидати невикористаний препарат через теоретичну можливість розмноження розчину мікробів.

Як дезінфікуючі складові при виробництві інсуліну можуть використовуватися такі речовини:

• метакрезол;
• фенол;
• парабени.

Якщо розчин містить іони цинку, вони також виступають додатковим консервантом через свої антимікробні властивості.

Для кожного виду інсуліну підходять певні дезінфікуючі компоненти. Їхню взаємодію з гормоном обов'язково досліджують на етапі доклінічних випробувань, оскільки консервант не повинен порушувати біологічну активність інсуліну або якось інакше негативно впливати на його властивості.

Використання консервантів у більшості випадків дозволяє вводити гормон під шкіру без попередньої обробки спиртом або іншими антисептиками (виробник зазвичай згадує про це в інструкції). Це спрощує введення ліків і скорочує кількість підготовчих маніпуляцій перед ін'єкцією. Але дана рекомендаціяпрацює тільки у разі введення розчину за допомогою індивідуального інсулінового шприцаз тонкою голкою.

Стабілізатори

Стабілізатори необхідні для того, щоб розчин pH підтримувався на заданому рівні. Від рівня кислотності залежить збереження ліків, його активність та стабільність хімічних властивостей. При виробництві ін'єкційного гормону для хворих на діабет із цією метою зазвичай використовують фосфати.

Для інсулінів із цинком стабілізатори розчинів потрібні не завжди, оскільки іони металу допомагають підтримувати необхідний баланс. Якщо ж вони таки застосовуються, то замість фосфатів використовують інші хімічні сполуки, оскільки комбінація цих речовин призводить до випадання осаду та непридатності ліків. Важлива властивість до всіх стабілізаторів – безпека і відсутність можливості вступати в будь-які реакції з інсуліном.

Підбором ін'єкційних ліків під час діабету для кожного конкретного пацієнта повинен займатися компетентний ендокринолог. Завдання інсуліну – не лише утримувати нормальний рівень цукру в крові, а й не шкодити іншим органам та системам. Препарат має бути нейтральним у хімічному плані, низькоалергенним та бажано доступним за ціною. Досить зручно також, якщо підібраний інсулін можна буде змішувати з іншими версіями за тривалістю дії.

Надіслати свою гарну роботу до бази знань просто. Використовуйте форму нижче

Студенти, аспіранти, молоді вчені, які використовують базу знань у своєму навчанні та роботі, будуть вам дуже вдячні.

Розміщено на http://www.allbest.ru/

Розміщено на http://www.allbest.ru/

Розміщено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ РЕСПУБЛІКИ КАЗАХСТАН

КАЗАХСЬКИЙ АГРОТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ С.СЕЙФУЛЛІНА

Кафедра мікробіології та біотехнології

КУРСОВА РОБОТА

З дисципліни «Біотехнології мокроорганізмів»

На тему: Технологія отримання інсуліну

Виконала: Мирзабек М?лдір Курбанбек?изи

Перевірила: Якимбаєва А.К (к. б. н.)

Астана - 2013

ВИЗНАЧЕННЯ

СКОРОЧЕННЯ ТА ПОЗНАЧЕННЯ

ВСТУП

1. Історія відкриття

2. Отримання інсуліну у біотехнології

3. Способи одержання інсуліну людини

4. Експресія проінсуліну у клітинах Е.coli

5. Очищення інсуліну

6. Спосіб застосування та дози

ВИСНОВОК

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

ВИЗНАЧЕННЯ

У цій роботі застосовувалися такі визначення:

Білок носій- забезпечує транспортування гібридного білка в периплазматичний простір клітини або культуральне середовище;

Афінний компонент - суттєво полегшує виділення гібридного білка.

Інсулін(Від лат. insula- острів) - гормон пептидної природи, що утворюється в бета-клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози.

Інтерлейкіни- група цитокінів, синтезована в основному лейкоцитами (з цієї причини було обрано закінчення лейкін).

Проінсулін- Це попередник інсуліну, що синтезується В-клітинами острівцевого апарату підшлункової залози.

Хроматогра фія(від грец. chroma, chromatos - колір, фарба) , фізико-хімічний метод поділу та аналізу сумішей, заснований на розподілі їх компонентів між двома фазами - нерухомий та рухомий (елюенти), що протікає через нерухому.

Інкапсуляція

Гібридний білок(англ. fusionprotein, також химерний, складовий білок) - білок, отриманий об'єднанням двох або більше генів, що спочатку кодували окремі білки.

Гормо ні(від грец. hormao - наводжу в рух, спонукаю), інкрети, біологічно активні речовини, що виробляються ендокринними залозами, або залозами внутрішньої секреції, і виділяються ними безпосередньо в кров.

Цукровийдіабет-група ендокринних захворювань, що розвиваються внаслідок абсолютної чи відносної недостатності гормону інсуліну

Інкапсуляція- механізм мови програмування, що обмежує доступ до складових об'єктів компонентів (методів та властивостей), робить їх приватними, тобто доступними лише всередині об'єкта.

Соматостатин- гормон дельта-клітин острівців Лангерганса підшлункової залози, а також один із гормонів гіпоталамуса.

Радіоімунний аналіз- метод кількісного визначення біологічно активних речовин, (гормонів, ферментів, лікарських препаратів та ін.) в біологічних рідинах, заснований на конкурентному зв'язуванні шуканих стабільних та аналогічних їм мічених радіонуклідом речовин зі специфічними системами, що зв'язують.

СКОРОЧЕННЯ ТА ПОЗНАЧЕННЯ

% - процентний зміст

ОФ - оберненофазовий

ВЕРХ – високоефективною рідинною хроматографією

ІО - іонообмінний

кДНК – комплементарна дезоксирибонуклеїнова кислота

MP-монопікові

MC - монокомпонентні

ФІТЦ - фенілізотіоціанатом

ВСТУП

Основна функція інсуліну – забезпечувати проникність клітинних мембран для молекул глюкози. У спрощеному вигляді можна сказати, що не тільки вуглеводи, а й будь-які поживні речовини, зрештою, розщеплюються до глюкози, яка і використовується для синтезу інших молекул, що містять вуглець, і є єдиним видом палива для клітинних енергостанцій - мітохондрій. Без інсуліну проникність клітинної мембрани для глюкози падає в 20 разів, і клітини помирають з голоду, а розчинений у крові надлишок цукру отруює організм.

Порушення секреції інсуліну внаслідок деструкції бета-клітин – абсолютна недостатність інсуліну – є ключовою ланкою патогенезу цукрового діабету 1-го типу. Порушення дії інсуліну на тканині – відносна інсулінова недостатність – має важливе місце у розвитку цукрового діабету 2-го типу.

Використання афінної хромотографії значно знизило вміст препарату забруднюючих білків з вищою м.м., ніж в інсуліну. До таких білків відносяться проінсулін та частково розщеплені проінсуліни, які здатні індукувати вироблення антиінсулінових антитіл.

Використання людського інсуліну від початку терапії зводить до мінімуму виникнення алергічних реакцій. Людський інсулін швидше абсорбується і, незалежно від форми препарату, має більш коротку тривалість дії, ніж тварини інсуліни. Людські інсуліни менш імуногенні, ніж свинячі, особливо змішані бичачі та свинячі інсуліни.

Метою даної курсової є вивчити технологію отримання інсуліну. Для досягнення були поставлені такі завдання:

1.отримання інсуліну в біотехнології

2. способи отримання інсуліну

З. очищення інсуліну

1. Історія відкриття

Історія відкриття інсуліну пов'язані з ім'ям російського лікаря І.М. Соболєва (друга половина 19 століття), який доказав, що рівень цукру в крові людини регулюється спеціальним гормоном підшлункової залози.

У 1922 році інсулін, виділений з підшлункової залози тварини, був вперше введений десятирічному хлопчику, хворому на діабет результат перевершив усі очікування, і вже через рік американська фірма "Eli Lilly"випустила перший препарат тваринного інсуліну

Після отримання першої промислової партії інсуліну в наступні кілька років пройдено величезний шлях його виділення та очищення. В результаті гормон став доступним для хворих на цукровий діабет 1 типу.

1935 року датський дослідник Хагедорн оптимізував дію інсуліну в організмі, запропонувавши пролонгований препарат.

Перші кристали інсуліну було отримано 1952 року, а 1954 року англійський біохімік Р. Сенджер розшифрував структуру інсуліну. Розвиток методів очищення гормону від інших гормональних речовин та продуктів деградації інсуліну дозволили отримати гомогенний інсулін, який називається однокомпонентним.

На початку 70-х років. радянськими вченими А. Юдаєвим та С. Швачкіним було запропоновано хімічний синтез інсуліну, проте здійснення даного синтезу у промисловому масштабі було дорогим та нерентабельним.

Надалі йшло прогресуюче поліпшення ступеня очищення інсулінів, що зменшувало проблеми, зумовлені алергією інсуліну, порушеннями роботи нирок, розладом зору та імунною резистентністю до інсуліну. Потрібен був найбільш ефективний гормон для замісної терапії при цукровому діабеті - гомологічний інсулін, тобто інсулін людини.

У 80-х роках досягнення молекулярної біології дозволили синтезувати з допомогою E.coliобидва ланцюги людського інсуліну, які були, потім з'єднані в молекулу біологічно активного гормону, а в Інституті біоорганічної хімії РАН отримано рекомбінантний інсулін з використанням генно-інженерних штамів E.coli.

2 . Одержання інсуліну у біотехнології

Інсулін, пептидний гормон острівців Лангерганса підшлункової залози, є основним засобом лікування при цукровому діабеті. Ця хвороба спричинена дефіцитом інсуліну та проявляється підвищенням рівня глюкози у крові. Донедавна інсулін отримували з підшлункової залози бика та свині. Препарат відрізнявся від людського інсуліну 1-3 амінокислотними замінами, тому виникала загроза алергічних реакцій, особливо у дітей. Широкомасштабне терапевтичне застосування інсуліну стримувалося його високою вартістю та обмеженістю ресурсів. Шляхом хімічної модифікації інсулін із тварин вдалося зробити невідмінним від людського, але це означало додаткове подорожчання продукту.

Компанія Eli Lillyз 1982 р. виробляє генно-інженерний інсулін на основі роздільного синтезу е. colieА - і В-ланцюгів. Вартість продукту значно знизилася, отримуваний інсулін ідентичний людському. З 1980 р. у пресі є повідомлення про клонування гена проінсуліну - попередника гормону, що переходить у зрілу форму при обмеженому протеолізі.

До лікування діабету додано також технологію інкапсулювання: клітини підшлункової залози в капсулі, введені одноразово в організм хворого, продукують інсулін протягом року.

Компанія Integrated Geneticsприступила до випуску фолі-кулостимулюючого та лютенізуючого гормонів. Ці пептиди складені з двох субодиниць. На порядку денному питання про промисловий синтез олігопептидних гормонів нервової системи -енкефалінів, побудованих з 5 амінокислотних залишків, та ендорфінів, аналогів морфіну. При раціональному застосуванні ці пептиди знімають. больові відчуття, створюють гарний настрій, підвищують працездатність, концентрують увагу, покращують пам'ять, упорядковують режим сну і неспання. Прикладом успішного застосування методів генетичної інженерії може бути синтез р-ендорфіну за технологією гібридних білків, описаної вище для іншого пептидного гормону, соматостатину.

3 . Способи одержання інсуліну людини

Історично першим способом отримання інсуліну для терапевтичних цілей є виділення аналогів цього гормону з природних джерел(Острівців підшлункової залози великої рогатої худоби та свиней). У 20-х роках минулого століття було встановлено, що бичачий та свинячий інсуліни (які є найбільш близькими до інсуліну людини за своєю будовою та амінокислотною послідовністю) виявляють в організмі людини активність, порівнянну з інсуліном людини. Після цього довгий часдля лікування пацієнтів, які страждають на цукровий діабет I типу, застосовували інсуліни бика або свині. Однак через деякий час було показано, що в ряді випадків в організмі людини починають накопичуватися антитіла до бичачого і свинячого інсулінів, тим самим зводячи нанівець їхню дію.

З іншого боку, однією з переваг цього методу отримання інсуліну є доступність вихідної сировини (бичачий і свинячий інсулін можна легко отримувати у великих кількостях), що відіграло вирішальну роль при розробці першого способу отримання інсуліну людини. Цей метод отримав назву напівсинтетичного.

При цьому способі отримання інсуліну людини як вихідну сировину використовували свинячий інсулін. Від очищеного свинячого інсуліну відщеплювали С-кінцевий октапептид В-ланцюга, після чого синтезували С-кінцевий октапептид людського інсуліну. Потім його хімічно приєднували, знімали захисні групи та очищали отриманий інсулін. При тестуванні даного методу одержання інсуліну було показано повну ідентичність отриманого гормону інсуліну людини. Основний недолік даного способу полягає у високій вартості інсуліну, що виходить (навіть зараз хімічний синтез октапептиду - дороге задоволення, тим більше в промисловому масштабі).

В даний час інсулін людини, в основному, отримують двома способами: модифікацією свинячого інсуліну синтетико-ферментативним методом та генно-інженерним способом.

У першому випадку метод заснований на тому, що свинячий інсулін відрізняється від інсуліну людини однією заміною на С-кінці В-ланцюга Ala30Thr. Заміну аланіну на треонін здійснюють шляхом каталізованого ферментом відщеплення аланіну і приєднання замість нього захищеного по карбоксильній групі залишку треоніну, присутнього в реакційній суміші у надлишку. Після відщеплення захисної О-трет-бутильної групи одержують інсулін людини. (Малюнок 1)

Рисунок 1 - Схема способу отримання інсуліну людини

Інсулін виявився першим білком, отриманим для комерційних цілей із використанням технології рекомбінантної ДНК. Існує два основні підходи для отримання генно-інженерного інсуліну людини. У першому випадку здійснюють роздільне (різні штами-продуценти) одержання обох ланцюгів з подальшим фолдингом молекули (утворення дисульфідних містків) та поділом мізоформ. У другому - одержання у вигляді попередника (проінсуліну) з подальшим ферментативним розщепленням трипсином та карбоксипептидазою. До активної форми гормону. Найбільш переважним в даний час є одержання інсуліну у вигляді попередника, що забезпечує правильність замикання дисульфідних містків (у разі роздільного одержання ланцюгів проводять послідовні цикли денатурації, поділу мізоформ та ренатурації).

При обох підходах можливе як індивідуальне одержання вихідних компонентів (А- та В-ланцюга або проінсулін), так і у складі гібридних білків. Крім А- і В-ланцюга або проінсуліну, у складі гібридних білків можуть бути:

1) білок носій - забезпечує транспортування гібридного білка в периплазматичний простір клітини або культуральне середовище;

2) афінний компонент - суттєво полегшує виділення гібридного білка.

При цьому обидва ці компоненти можуть бути присутніми одночасно в складі гібридного білка. Крім цього, при створенні гібридних білків може використовуватися принцип мультимірності (тобто в гібридному білку є кілька копій цільового поліпептиду), що дозволяє істотно підвищити вихід цільового продукту.

4 . Експресія проінсуліну у клітинахЕ.coli

У роботі використовували штам JM 109 N1864з вбудованою в плазміду нуклеотидною послідовністю, що експресує гібридний білок, який складається з лінійного проінсуліну і приєднаного до його N-кінця через залишок метіоніну фрагмента білка АStaphylococcusaureus.Культивування насиченої біомаси клітин рекомбінантного штаму забезпечує початок виробництва гібридного білка, виділення та послідовна трансформація якого intubeпризводять до інсуліну. Інша група дослідників отримувала в бактеріальній системі експресії злитий рекомбінантний білок, що складається з проінсуліну людини і приєднаного до нього через залишок полігістидинового метіоніну "хвоста". Його виділяли, використовуючи хелатну хроматографію на колонках з Ni-агарозою з тілець включення та розщеплювали бромціаном. Автори визначили, що виділений білок є S-сульфурованим. Картування та мас-спектрометричний аналіз отриманого проінсуліну, очищеного іоннообмінною хроматографією на аніоніті та ОФ (наверненофазовою) ВЕРХ (високоефективною рідинною хроматографією), показали наявність дисульфідних містків, що відповідають дисульфідним місткам нативного проінсуліну. Також повідомляється про розробку нового, вдосконаленого способу одержання інсуліну людини методами генної інженерії у прокаріотичних клітинах. Авторами встановлено, що отриманий інсулін за своєю будовою та біологічною активністю ідентичний гормону, виділеному із підшлункової залози.

Останнім часом пильну увагу приділяють спрощенню процедури отримання рекомбінантного інсуліну методами генної інженерії. Так отримали злитий білок, що складається з лідерного пептиду інтерлейкіну, приєднаного до N-кінця проінсуліну, через залишок лізину. Білок ефективно експресувався та локалізувався у тільцях включення. Після виділення білок розщеплювався трипсином з одержанням інсуліну та С-пептиду. Інша група дослідників діяла аналогічним способом. Злитий білок, що складається з проінсуліну та двох синтетичних доменів білка А стафілококів, що зв'язують IgG,локалізувався в тільцях включення, але мав вищий рівень експресії. Білок виділявся афінною хроматографією з використанням IgG і оброблявся трипсином та карбоксипептидазою В. Отримані інсулін та С-пептид очищалися ОФ ВЕРХ. При створенні злитих конструкцій дуже істотним є співвідношення мас носія білка і цільового поліпептиду. Так описано конструювання злитих конструкцій, де як поліпептид - носій використовували білок, що зв'язує сироватковий альбумін людини. До нього приєднували один, три та сім С-пептидів. С-пептиди з'єднувалися за принципом "голова-хвіст" за допомогою амінокислотних спейсеров, що несуть сайт рестрикції Sfi Iі два залишки аргініну на початку та наприкінці спейсера для подальшого розщеплення білка трипсином. ВЕРХ продуктів розщеплення показала, що відщеплення С-пептиду проходить кількісно, ​​а це дозволяє використовувати спосіб синтетичних мультимерних генів для отримання цільових поліпептидів в промисловому масштабі.

Отримання мутанта проінсуліну, який містив заміну Arg32Tyr. При спільному розщепленні цього білка трипсином і карбоксипептидазою утворювався нативний інсулін і С-пептид містить залишок тирозину. Останній, після мічення 125I, активно використовується у радіоімунному аналізі.

5 . Очищення інсуліну

Інсулін, призначений для виготовлення лікарських препаратів, має бути високою чистотою. Тому необхідний високоефективний контролю над чистотою одержуваних продуктів кожної стадії виробництва. Раніше за допомогою ОФ та ІО (іонообмінної) ВЕРХ були охарактеризовані проінсулін-S-сульфонат, проінсулін, окремі А- та В-ланцюги та їх S-сульфонати. Також особлива увагаприділяється флуоресцентним похідним інсуліну. У роботі автори досліджували застосовність та інформативність хроматографічних методів при аналізі продуктів усіх стадій виробництва інсуліну людини та склали регламент хроматографічних операцій, що дозволяє ефективно розділяти та охарактеризувати отримані продукти. Автори розділяли похідні інсуліну використовуючи біфункціональні сорбенти (гідрофобна та іонообмінна ОФ ВЕРХ) та показали можливість управління селективністю поділу шляхом варіювання вкладу кожної із взаємодій, завдяки чому досягається більша ефективність при поділі близьких аналогів білка. Крім того, розробляються підходи для автоматизації та прискорення процесів визначення чистоти та кількості інсуліну. Повідомляється про дослідження можливості застосування ОФ рідинної хроматографії з електрохімічним детектуванням для визначення інсуліну та розроблено методику визначення інсуліну, виділеного з острівця Лангерганса методом імуноафінної хроматографії зі спектрометричним детектуванням. В роботі досліджували можливість застосування швидкого мікровизначення інсуліну з використанням капілярного електрофорезу з лазерно-флуоресцентним детектуванням. Аналіз виконується шляхом додавання до проби відомої кількості інсуліну, міченого фенілізотіоціанатом (ФІТЦ) та фрагмента Fab моноклональних антитіл на інсулін. Мічений та звичайний інсуліни конкурентно вступають у реакцію утворення комплексу із Fab.Мічений ФІТЦ інсулін та його комплекс з Fab поділяють за 30 секунд.

Останнім часом велика кількістьробіт присвячено удосконаленню способів одержання інсуліну, а також створенню лікарських формз його основі. Наприклад, у США запатентовані гепатоспецифічні аналоги інсуліну, структурно відрізняються від природного гормону за рахунок введення в положення 13 - 15 і 19 А-ланцюга і положення 16 В-ланцюга інших амінокислотних залишків. Отримані аналоги використовуються у складі різних парентеральних (внутрішньовенні, внутрішньом'язові, підшкірні), інтраназальних лікарських форм або імплантації у вигляді спеціальних капсул при лікуванні цукрового діабету. Особливо актуальним є створення лікарських форм, що вводяться без ін'єкцій. Повідомляється про створення макромолекулярної системи перорального застосування, що являє собою іммобілізований інсулін в обсязі полімерного гідрогелю, модифікованого інгібіторами протеолітичних ферментів. Ефективність такого препарату становить 70-80% ефективності підшкірно введеного нативного інсуліну. В іншій роботі лікарський препарат одержують одноетапною інкубацією інсуліну з еритроцитами, взятими у співвідношенні 1-4:100, у присутності зв'язуючого агента. Автори повідомляють про отримання лікарського препарату з активністю 1000 од./г., повне збереження активності при пероральному введенні та зберіганні протягом декількох років у ліофілізованому вигляді.

Крім створення нових лікарських засобів та лікарських форм на основі інсуліну, розробляються нові підходи до вирішення проблеми цукрового діабету. Так, трансфікували кДНК білка переносника глюкози. GLUT2попередньо стабільно трансфіковані повнорозмірні кДНК інсуліну клітини НЕР G2 ins. В отриманих клонах НЕР G2 Insglглюкоза стимулює близьку до нормальної секрецію інсуліну та потенціює секреторну відповідь на інші стимулятори секреції. При імуноелектронній мікроскопії в клітинах виявлені гранули, що містять інсулін, морфологічно подібні з гранулами в b-клітинах острівців Лангерганса. На даний момент серйозно обговорюється можливість застосування для лікування цукрового діабету 1 типу "штучної b-клітини", отриманої методами генної інженерії.

Поряд із вирішенням практичних проблем вивчаються і механізми дії інсуліну, а також структурно-функціональні відносини у молекулі. Одним із способів дослідження є створення різних похідних інсуліну та вивчення їх фізико-хімічних та імунологічних властивостей. Як уже говорилося вище, ряд методів виробництва інсуліну заснований на отриманні даного гормону у вигляді попередника (проінсуліну) з подальшим розщепленням ферментативним до інсуліну і С-пептиду. В даний час для С-пептиду показано наявність біологічної активності, що дозволяє використовувати його з терапевтичною метою поряд з інсуліном. У наступних статтях цієї серії буде розглянуто фізико-хімічні та біологічні властивості С-пептиду, а також методи його отримання.

Значний внесок біотехнології та в промислове виробництвонепептидних гормонів, насамперед стероїдів. Методи мікробіологічної трансформації дозволили різко скоротити кількість етапів хімічного синтезу кортизону, гормону надниркових залоз, що застосовується для лікування ревматоїдного артриту. При виробництві стероїдних гормонів широко використовують іммобілізовані мікробні клітини, наприклад Arthrobacterglobiformisдля синтезу преднізолону з гідрокортизону. Є розробки з отримання гормону щитовидної залозитироксину із мікроводоростей.

За ступенем очищення

· традиційні- Екстрагуються кислим етанолом, а в процесі очищення фільтруються, висолюються і багаторазово кристалізуються (метод не дозволяє очистити препарат від домішок інших гормонів, що містяться в підшлунковій залозі)

· монопікові (MP) - після традиційного очищення фільтруються на гелі (при проведенні гельхроматографії утворюють всього один «пік»: вміст перерахованих вище домішок не більше 1·10 ?3

· Монокомпонентні (MC) - піддаються ще глибшому очищенню за допомогою молекулярного сита та методу іонообмінної хроматографії на DEAE-целюлозі, що дозволяє досягти 99% ступеня їх чистоти (1 · 10? 6) (рисунок 2)

Малюнок 2- Схема очищення інсуліну

інсулін цукровий діабет біотехнологія

6 . Спосіб застосування та дози

Визначаються та регулюються суворо під медичним наглядом відповідно до стану пацієнта. Усі препарати хумуліну можуть вводитись підшкірно або внутрішньовенно; Хумулін Р в ампулах вводиться внутрішньовенно. Підшкірне введення, краще пацієнтам, слід робити у верхню частину руки, стегна, сідниці або в черевну область. Місця уколу потрібно міняти, щоб одна й та сама частина тіла використовувалася не частіше ніж один раз на місяць. При цьому не повинні торкатися капіляри. Місце уколу не потребує масажу. Патрончики з хумуліном використовуються тільки для ін'єкції в Пінах Бектона Дікінсона. При цьому необхідно ретельно дотримуватися вказівок виробника, зазначених на Пінах під час їх заправлення та застосування. Пацієнти повинні завжди мати під рукою запасний шприц та ампулу з хумуліном на випадок, якщо ПЕН - пристрій для ін'єкції або патрончик буде втрачено. Профілі дії хумуліну. Хумулін Р: початок дії через 10 хвилин, максимум дії – між 1 та 3 годинами, тривалість дії – від 5 до 7 годин. Хумулін Н: початок дії – через 30 хвилин, максимум дії – між 2 та 8 годинами, тривалість дії – від 18 до 20 годин. Хумулін М1: початок дії – через 30 хвилин, максимум дії – між 2 та 9 годинами, тривалість дії – від 16 до 18 годин. Хумулін М2: початок дії – через 30 хвилин, максимум дії між 1,5 та 9 годинами, тривалість дії – від 14 до 16 годин. Хумулін М3: початок дії – через 30 хвилин, максимум дії – між 1 та 8,5 годинами, тривалість дії – від 14 до 15 годин. Хумулін М4: початок дії – через 30 хвилин, максимум дії – між 1 та 8 годинами, тривалість дії – від 14 до 15 годин. Хумулін Л: початок дії – через 2 години, максимум дії – між 4 та 16 годинами, тривалість дії – близько 24 годин. Хумулін У: початок дії – через 3 години, максимум дії – між 3 та 18 годинами, тривалість дії – від 24 до 28 годин. Терапія одним препаратом. Хумулін Р можна вводити без інших видів інсуліну, використовуючи багаторазові щоденні ін'єкції. Хумулін Н, Л та У також можна вводити самостійно 1-2 рази на день. Комбінована терапія. Для посилення початкового ефекту деяким пацієнтам додатково до хумуліну Р призначають хумуліни Н, Л та У. Одночасне застосування інсулінів тваринної групи, випущених різними фірмами, не рекомендується. Хумулін М не вимагає комбінаційної терапії, його вводять двічі на день (2/3 щоденної потребивранці, решта – увечері). Для будь-якого введення доза не повинна перевищувати 50 одиниць. Пацієнт зобов'язаний інформувати лікаря про вагітність. У цей період необхідний суворий контроль за станом здоров'я інсулінозалежної пацієнтки. Потреба в препараті зазвичай зменшується у першому триместрі та збільшується у другому та третьому. Пацієнткам з діабетом під час лактації потрібна корекція дози інсуліну (і дієти).

ВИСНОВОК

Цукровий діабет – хронічне захворювання, обумовлене абсолютною або відносною недостатністю інсуліну. Воно характеризується глибоким порушенням обміну вуглеводів з гіперглікемією та глікозурією, а також іншими порушеннями обміну речовин внаслідок впливу низки генетичних та зовнішніх факторів.

Інсулін до сьогодні служить радикальним, а в більшості випадків єдиним засобом для підтримки життя та працездатності хворих на цукровий діабет. До отримання та застосування інсуліну в клініку в 1922-1923 рр. хворих на цукровий діабет I типу чекав летальний кінець протягом одного-двох років з початку захворювання, незважаючи на застосування найбільш виснажливих дієт. Хворі на цукровий діабет I типу потребують довічної замісної терапії препаратами інсуліну. Припинення через ті чи інші причини регулярного введення інсуліну веде до швидкого розвитку ускладнень і швидкої загибелі хворого.

В даний час цукровий діабет за поширеністю знаходиться на 3-му місці після серцево-судинних та онкологічних захворювань. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, поширеність цукрового діабету серед дорослого населення у більшості регіонів світу становить 2-5 % і є тенденція збільшення кількості хворих майже вдвічі кожні 15 років. Незважаючи на очевидний прогрес у галузі охорони здоров'я, чисельність інсулінозалежних хворих збільшується з кожним роком і зараз тільки в Росії становить близько 2 мільйонів осіб.

Створення препаратів вітчизняного генно-інженерного інсуліну людини відкриває нові можливості вирішення багатьох проблем для порятунку життя мільйонів людей, які страждають на цукровий діабет.

Цукровий діабет посідає третє місце у світі після серцево-судинних та онкологічних недуг. За різними джерелами, у світі налічується від 120 до 180 млн. хворих на діабет, що становить 2-3 відсотків від усього населення планети. За прогнозами вчених, кожні 15 років очікується дворазове збільшення числа хворих.

На мою думку, інсулін є одним із найбільш вивчених гормонів. З моменту відкриття того факту, що інсулін, що виробляється підшлунковою залозою, відповідає за зниження рівня цукру в крові, до цього часу минуло вже понад 80 років. Тим не менш, і до цього дня цей гормон викликає величезний інтерес.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Ре, Л. Оптимізація біотехнологічного виробництва субстанцій рекомбінантних інтерферонів людини; пров. з франц.- М.: Світ, 2002.-С. 140-143.

2. Шевелуха, В. С. Сільськогосподарська біотехнологія / Ст. З. Шевелуха, Є. А. Калашнікова, 4-те изд.- М.: Вид-во Вища школа, 2003.-437 з.

3. Сміт,О. Державний реєстр лікарських засобів; пров. з англ.- М.: Світ, 2003.-С. 37-39.

4. Грищенко, В. І. . Молекулярна біотехнологія інтерферонів – 2008.-Т. 11, вип. 7.-Харків. 238.

5. Садченко, Л. С. Сучасні досягнення біотехнології у медичній промисловості. -2008.-М. 31, вип. 5.-Л. 213.

6. Сучасна біотехнологія [Електронний ресурс]: сайт з біотехнології. - Режим доступу: http://www.bionews.ru/news/Bio.htm

7. Марініва А.К. Виробництво білкових речовин. Біотехнологія – 2007.-Т. 51, вип. 5.-СПб. 17.

8.http://ua.wikipedia.org/wiki/

9.http://www.medichelp.ru/

10.http://mikrobio.ho.ua/

Розміщено на Allbest.ru

Подібні документи

Забезпечення проникності клітинних мембран для молекул глюкози інсуліном – гормоном пептидної природи. Реакції на препарати інсуліну: імунологічна інсулінорезистентність, алергія, ліподистрофія. Одержання інсуліну, різновид препаратів.

реферат, доданий 05.02.2010


Історія створення та механізм дії інсуліну, який є білково-пептидним гормоном, що виробляється клітинами острівців Лангерганса підшлункової залози. Методи одержання. Недоліки тваринного інсуліну. Переваги біотехнологічного інсуліну.

презентація , доданий 15.03.2016


Етіологія та патогенез, класифікація цукрового діабету, інсулінотерапія. Фармакокінетика препаратів інсуліну, його взаємодія з іншими лікарськими засобами. Трансбукальний та сублінгвальний, інгаляційний шляхи доставки в організм людини.

дипломна робота , доданий 16.10.2014


Підвищення якості життя хворих на цукровий діабет. Розрахунок складу харчового раціону. Призначення інсуліну, розрахунок його дози, розподіл інсуліну протягом доби. Процеси біосинтезу та секреції інсуліну. Застосування синусоїдального модульованого струму.

презентація , доданий 20.10.2014


Вивчення будови та дії інсуліну. Секреція та синтез глюкогону. Дослідження симптомів та діагностика цукрового діабету. Характеристика захворювання на ендокринну систему. Застосування лікарських препаратів та хімічних речовин при лікуванні хвороби.

презентація , додано 12.10.2015


Поняття та функції гормонів. Мікробіологічні трансформації стероїдів, які мають промислове застосування. Сировина синтезу стероїдних гормонів. Генно-інженерний метод одержання соматостатину. Створення інсуліну з урахуванням технології рекомбінантних ДНК.

презентація , доданий 22.12.2016


Особливості лікування цукрового діабету І типу. Використання дієтотерапії, фізичного навантаження, інсулінотерапії. Критерії компенсації цукрового діабету. Рекомендації щодо режиму фізичних навантажень. Хронічна передозування інсуліну (синдром Сомоджі).

презентація , доданий 23.09.2016


Етіологія та клінічні проявицукровий діабет. Види інсуліну, правила зберігання. Поняття та схеми інсулінотерапії. Вивчення ускладнень після ін'єкції інсуліну. Роль медичної сестри у питаннях навчання пацієнтів із цукровим діабетом.

курсова робота , доданий 01.06.2016


Порушення внутрішньої секреції підшлункової залози. Особливості симптомів цукрового діабету, випадки підвищеного вмісту інсуліну у крові. Методи розпізнавання різних видів гіпоглікемії. Гіпотези причин ушкодження роботи підшлункової залози.

реферат, доданий 28.04.2010


Оцінка ефективності лікування діабету. Клініко-діагностичне значення глюкози у спинномозковій рідині. Основні особливості глюкозотолерантного тесту. Крива після одноразового навантаження глюкозою. Крива секреції інсуліну для діабету другого ступеня.