Inzulín: čo to je a aké druhy existujú? Z čoho sa vyrába inzulín pre diabetikov: moderná výroba a spôsoby výroby Z čoho sa vyrába inzulín?

Moderná biotechnologická výroba inzulínu je komplexný proces založený na genetickej modifikácii mikroorganizmov. Táto metóda je relatívne nová a do výroby bola zavedená v osemdesiatych rokoch minulého storočia. S jeho pomocou sa získa liek, ktorý plne zodpovedá tomu, čo sa vyrába v ľudskom tele. Odtiaľ pochádza názov „ľudský inzulín“.

Treba poznamenať, že tento výraz „ľudský inzulín“ niekedy spôsobuje trochu nesprávne reakcie a predpoklady, že liek sa získava z ľudského tela. Z tohto dôvodu sa tak často kladie otázka: „Ako sa vyrába inzulín? - a odkiaľ sa vzala táto definícia?

Až donedávna bola totiž technológia výroby inzulínu úplne iná. Extrahovalo sa z tela ošípaných alebo hovädzieho dobytka a podľa toho sa nazývalo napríklad bravčové alebo hovädzie. Táto výrobná technológia je však zastaraná a má množstvo vážnych nevýhod, medzi ktorými je na prvom mieste nemožnosť získať čistú látku bez proinzulínových nečistôt, ktorá spôsobuje u ľudí rôzne alergické reakcie a tvorbu protilátok.

V dôsledku neustáleho nárastu počtu ľudí s cukrovkou navyše nie je dostatok živočíšnych surovín na výrobu inzulínu, čo sa stalo ďalším impulzom pre hľadanie moderných nových metód na jeho umelú výrobu.

Dnes sa ľudský alebo rekombinantný liek získava z kmeňov kvasiniek alebo E. coli. Tieto látky neboli vybrané náhodou: počas svojho rastu v živnom médiu produkujú obrovské množstvá potrebného hormónu. To znamená, že proces nie je len technologickej povahy, ale aj biologický, pretože požadovanú látku produkujú živé organizmy a potom sa transformujú, a nie chemicky syntetizujú.

Treba poznamenať, že veda prešla zložitou a náročnou cestou, kým sa našla a zaviedla do výroby biotechnologická metóda výroby lieku pre diabetikov. Presné zloženie inzulínu produkovaného ľuďmi bolo prvýkrát stanovené v šesťdesiatych rokoch minulého storočia. Ukázalo sa, že jeho molekuly majú iné zloženie aminokyselín, odlišné od aminokyselín živočíšneho pôvodu. Neskôr sa robili pokusy nahradiť jednu aminokyselinu inou, mimochodom, celkom úspešne, ale veľmi draho. Táto metóda bola uznávaná ako nerentabilná a neperspektívna nielen u nás, ale aj v zahraničí.

A až po dvoch desaťročiach tvrdej práce bolo možné získať absolútne čistý liek, úplne v súlade s tým, čo sa vyrába v tele zdravého človeka, a nespôsobuje odmietnutie ani alergické reakcie.

Výroba ľudského inzulínu je založená na metóde genetického inžinierstva, počas ktorej sa do molekuly DNA kvasiniek vloží gén, ktorý podmieňuje produkciu hormónu úplne podobného tomu, ktorý produkuje človek. Táto metóda je široko používaná vo všetkých vyspelých krajinách sveta a umožňuje získať lieky na liečbu cukrovky vynikajúcej kvality a v správnom množstve.

V blízkej budúcnosti sa plánuje vlastná výroba inzulínu v Rusku. Výstavba dielne na Urale už prebieha. V súčasnosti sa však v zahraničí nakupujú lieky na liečbu pacientov s cukrovkou, na ktoré sa vynakladajú obrovské sumy z rozpočtu krajiny.

Treba poznamenať, že technológia jeho výroby už bola experimentálne testovaná v Rusku a boli dosiahnuté vynikajúce výsledky. Naše domáce drogy sa ukázali byť účinnejšie a čistejšie. Zostáva už len zaviesť výrobný proces.

Recenzie a komentáre

Zanechajte recenziu alebo komentár

Nemenej užitočné materiály na túto tému:

Formulár na uvoľnenie

Inzulín je liek, ktorý má schopnosť znižovať hladiny glukózy, keď sa odchyľujú od normy a regulovať proces absorpcie uhľohydrátov v tele. Je nepostrádateľný pri liečbe cukrovky a pri správnom dávkovaní a včasnom začatí terapie umožňuje chorým ľuďom viesť plnohodnotný život....

Kazety

Inzulín v náplniach je určený na podávanie pomocou takzvaných perových striekačiek, ktoré dostali svoj názov vďaka vonkajšej podobnosti s automatickým plniacim perom. Injekčné pero umožňuje dávkovať množstvo vstreknutého lieku, čo výrazne zjednodušuje život pacientov s cukrovkou. V tomto prípade nie je potrebné...

V ampulkách

Inzulín je hormón pankreasu. Na výrobu liekov na jeho základe sa používajú zvieracie orgány, ako aj biotechnológie, ktoré umožňujú získať látky podobné ľudským hormónom. Charakteristickým znakom inzulínu je jeho nestabilita voči účinkom enzýmov obsiahnutých v tráviacom trakte. To znamená, že inzulín...

Tabletky namiesto inzulínu

Inzulín je hormón. Vyrába sa v zdravom pankrease. Diabetes sa vyskytuje, keď je pankreas chorý alebo sa jednoducho nedokáže vyrovnať s jeho funkciami. Dnes je liečba cukrovky založená na zavedení hormónu získaného umelo do tela pacienta...

Kto vynašiel inzulín?

Objav inzulínu nastal v roku 1922. Práve vtedy chlapcovi, ktorý bol vážne chorý na cukrovku, vpichli liek získaný z pankreasu býka. Vďaka tomu sa podarilo nielen zachrániť životy, ale aj zastaviť postupujúcu chorobu. História samotného inzulínu nie je bez zázrakov...

Vzorec a štruktúra inzulínu

Štruktúra inzulínu zaujíma vedcov už od jeho objavu. Početné experimenty v tomto smere začali jeho objavitelia Frederick Banting a Charles Best. Vedci sa zároveň pokúsili stanoviť presný chemický vzorec izolovaného hormónu, ktorý by umožnil jeho chemickú syntézu. Beží...

Inzulín je regulátorom metabolizmu uhľohydrátov. V ľudskom tele sa inzulín syntetizuje v beta bunkách Langerhansových ostrovčekov v pankrease. Pri absencii alebo nedostatku jeho syntézy sa vyvinie ochorenie, ako je diabetes mellitus (diabetes závislý od inzulínu - 1. typu). Pri diabete mellitus sa zvyšuje hladina glukózy v krvi a rozvíjajú sa patologické procesy. Diabetes typu II (závislý od inzulínu) sa vyskytuje, keď sú defekty v štruktúre receptorov zodpovedných za prenikanie glukózy do bunky. Všetky tieto informácie sa týkajú etiológie ochorenia, akým je cukrovka.

Inzulín je peptidový hormón pozostávajúci z dvoch peptidových reťazcov: A reťazec pozostáva z 21 aminokyselinových zvyškov. Reťazec B pozostáva z 30 aminokyselinových zvyškov. Tieto dva reťazce sú spojené SS bisulfidovými väzbami, ktoré poskytujú priestorovú štruktúru inzulínového proteínu. Keď sa inzulín syntetizuje v pankrease, najprv sa vytvorí prekurzor inzulínu, takzvaný proinzulín. Tento proinzulín pozostáva z A-reťazca, B-reťazca a C-peptidu pozostávajúceho z 35 aminokyselinových zvyškov. C-peptid sa štiepi karboxypeptidázou a trypsínom a proinzulín sa premieňa na aktívny inzulín.

Existujú rôzne spôsoby, ako získať inzulín. Zameriame sa na výrobu inzulínu biosynteticky, z pohľadu výhod tejto metódy.

Pred získaním rekombinantného inzulínu sa liek získal z pankreasu ošípaných a hovädzieho dobytka. Tento spôsob výroby inzulínu mal však niekoľko nevýhod:

− nedostatok hospodárskych zvierat;

− ťažkosti pri skladovaní a preprave surovín;

− ťažkosti s izoláciou a čistením hormónu;

- možnosť vzniku alergických reakcií.

Takýto inzulín, ako cudzorodý proteín, môže byť tiež v krvi inaktivovaný vytvorenými protilátkami. Okrem toho na získanie 1 kilogramu inzulínu je potrebných 35 000 kusov ošípaných (ak je známe, že ročná potreba inzulínu je 1 tona lieku). Na druhej strane, rovnaké množstvo inzulínu možno získať biosynteticky vykonaním biosyntézy v 25 nádobovom fermentore s použitím rekombinantného mikroorganizmu Escherichia coli. Biosyntetický spôsob výroby inzulínu sa začal používať začiatkom 80. rokov.

V súčasnosti sa ľudský inzulín získava hlavne dvoma spôsobmi:

1) modifikácia bravčového inzulínu pomocou synteticko-enzymatickej metódy;

Metóda je založená na skutočnosti, že bravčový inzulín sa líši od ľudského inzulínu jednou substitúciou na C-konci B reťazca, Ala30Thr. Nahradenie alanínu treonínom sa uskutočňuje enzýmovo katalyzovaným štiepením alanínu a pridaním treonínového zvyšku chráneného karboxylovou skupinou, ktorý je prítomný v reakčnej zmesi vo veľkom prebytku, namiesto. Po odštiepení ochrannej O-terc-butylovej skupiny sa získa ľudský inzulín.

2) genetickým inžinierstvom;

Existujú dva hlavné prístupy k získaniu geneticky upraveného ľudského inzulínu.

V prvom prípade (2.1) sa obidva reťazce získajú oddelene (z rôznych produkčných kmeňov), potom nasleduje poskladanie molekuly (tvorba disulfidových mostíkov) a separácia izoforiem.

V druhom (2.2) - produkcia vo forme prekurzora (proinzulínu) s následným enzymatickým štiepením trypsínom a karboxypeptidázou B na aktívnu formu hormónu.

Najvýhodnejšou metódou v súčasnosti je získanie inzulínu vo forme prekurzora, zabezpečujúceho správne uzatvorenie disulfidových mostíkov (v prípade oddelenej výroby reťazcov sa uskutočňujú postupné cykly denaturácie, separácie izoforiem a renaturácie).

Metóda 2.1. Samostatná syntéza A- a B-reťazcov s následnou tvorbou disulfidových väzieb medzi nimi

1. Chemickou syntézou vznikajú nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú tvorbu reťazcov A a B (tvorba syntetických génov).

2. Každý zo syntetických génov sa zavedie do plazmidov (reťazec syntetizujúci gén A sa zavedie do jedného plazmidu, reťazec syntetizujúci gén sa zavedie do iného plazmidu).

3. Zavedie sa gén kódujúci tvorbu enzýmu betagalaktozidáza. Tento gén je zahrnutý v každom plazmide, aby sa dosiahla aktívna replikácia plazmidov.

4. Plazmidy sa zavedú do bunky E. coli a získajú sa dve produkčné kultúry, jedna kultúra syntetizuje A-reťazec, druhá B-reťazec.

5. Do fermentora vložte dve kultúry. Do média sa pridá galaktóza, ktorá vyvolá tvorbu enzýmu betagalaktozidázy. V tomto prípade sa plazmidy aktívne replikujú, tvoria mnoho kópií plazmidov a následne aj mnoho génov, ktoré syntetizujú reťazce A a B.

6. Bunky sa lýzujú a izolujú sa reťazce A a B, ktoré sú spojené s betagalaktozidázou. To všetko je ošetrené brómkyánom a reťazce A a B sa odštiepia z betagalaktozidázy. Potom sa uskutoční ďalšie čistenie a izolácia reťazcov A a B.

7. Zvyšky cysteínu sa oxidujú, viažu a získava sa inzulín.

Nevýhody tejto metódy: je potrebné získať dva oddelené výrobné kmene, vykonať dve fermentácie, dve izolačné a purifikačné postupy a čo je najdôležitejšie, je ťažké zabezpečiť správne uzavretie disulfidových väzieb, teda získať aktívny inzulín .

Metóda 2.2. Syntéza proinzulínu s následným uvoľnením C-peptidu.

Konformácia proinzulínu zároveň zabezpečuje správne uzatvorenie disulfidových väzieb, čo robí druhý spôsob mikrobiologickej syntézy sľubnejším.

V Ústave bioorganickej chémie Ruskej akadémie vied bol získaný rekombinantný inzulín (insuran) pomocou geneticky upravených kmeňov E. coli. Z vypestovanej biomasy sa izoluje prekurzor, hybridný proteín exprimovaný v množstve 40 % z celkového bunkového proteínu, obsahujúci preproinzulín. Jeho premena na inzulín in vitro prebieha v rovnakom poradí ako in vivo – hlavný polypeptid sa odštiepi, preproinzulín sa premení na inzulín cez stupne oxidačnej sulfitolýzy, po ktorej nasleduje redukčné uzavretie troch disulfidových väzieb a enzymatická izolácia väzbový C-peptid. Po sérii chromatografických čistení, vrátane iónovej výmeny, gélu a HPLC, sa získa ľudský inzulín vysokej čistoty a prirodzenej účinnosti.

Na rozdiel od inzulínu sa aminokyselinová sekvencia c-peptidu veľmi líši medzi rôznymi druhmi cicavcov, čo znemožňuje jeho získanie zo živočíšnych zdrojov. Existujúce spôsoby výroby c-peptidu možno rozdeliť do troch kategórií:

1) Príprava c-peptidu chemickou syntézou. Táto metóda sa používa na získanie väčšiny lieku, ktorý je v súčasnosti na trhu.

2) Príprava c-peptidu biosyntetickými metódami ako súčasť fúznych proteínov. Na získanie c-peptidu týmto spôsobom sa vytvorí chimérický proteín, v ktorom za vedúcim fragmentom nasleduje niekoľko c-peptidových sekvencií oddelených aminokyselinami, ktoré zaisťujú hydrolýzu špecifickými proteázami. V prvej fáze sa mikroorganizmy kultivujú vo fermentoroch, potom sa v nich indukuje syntéza rekombinantného polypeptidu; bunky sú zničené a rekombinantný proteín je purifikovaný a spracovaný špecifickými proteázami, čo vedie k c-peptidu. V konečnom štádiu sa c-peptid čistí od nečistôt. Táto metóda môže poskytnúť veľké objemy produkcie, ale vyžaduje vytvorenie produkčných kmeňov, vývoj podmienok pre kultiváciu mikroorganizmov, metódy purifikácie rekombinantného proteínu, ako aj vytvorenie a validáciu metód kontroly kvality.

3) Príprava c-peptidu biosyntetickými metódami spolu s inzulínom. Tento spôsob výroby zahŕňa zavedenie určitých modifikácií do technológie výroby rekombinantného inzulínu s cieľom optimalizovať produkciu c-peptidu vytvoreného v určitých štádiách výroby, ktorý je založený na produkcii proinzulínu, ktorý nepodlieha modifikáciám. Táto metóda má množstvo výhod. Na získanie c-peptidu touto metódou nie je potrebné vytvárať nové produkčné kmene, vyvíjať technológiu na čistenie a skladanie proteínov, ani vytvárať nové inštrumentálne metódy na riadenie výrobného procesu.

Inzulín je hormón, ktorý zohráva rozhodujúcu úlohu pri zabezpečovaní normálneho fungovania ľudského tela. Je produkovaný bunkami pankreasu a podporuje vstrebávanie glukózy, ktorá je hlavným zdrojom energie a hlavnou výživou pre mozog.

Ale niekedy, z jedného alebo druhého dôvodu, sekrécia inzulínu v tele výrazne klesá alebo sa úplne zastaví, čo s tým robiť a ako si pomôcť. To vedie k vážnemu narušeniu metabolizmu uhľohydrátov a rozvoju takej nebezpečnej choroby, ako je cukrovka.

Bez včasnej a primeranej liečby môže toto ochorenie viesť k vážnym následkom, vrátane straty zraku a končatín. Jediným spôsobom, ako zabrániť rozvoju komplikácií, sú pravidelné injekcie umelo vyrobeného inzulínu.

Z čoho sa však vyrába inzulín pre diabetikov a ako pôsobí na organizmus pacienta? Tieto otázky zaujímajú mnohých ľudí s diagnózou cukrovky. Aby sme to pochopili, je potrebné zvážiť všetky metódy získavania inzulínu.

Odrody

Moderné inzulínové prípravky sa líšia nasledujúcimi spôsobmi:

• zdroj pôvodu;
• Trvanie akcie;
• pH roztoku (kyslé alebo neutrálne);
• Prítomnosť konzervačných látok (fenol, krezol, fenol-krezol, metylparabén);
• Koncentrácia inzulínu - 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Tieto znaky ovplyvňujú kvalitu lieku, jeho cenu a stupeň vplyvu na telo.

Zdroje

Hladina cukru

V závislosti od zdroja výroby sú inzulínové prípravky rozdelené do dvoch hlavných skupín:

Zvieratá. Získavajú sa z pankreasu hovädzieho dobytka a ošípaných. Môžu byť nebezpečné, pretože často spôsobujú vážne alergické reakcie. To platí najmä pre hovädzí inzulín, ktorý obsahuje tri aminokyseliny, ktoré sa nenachádzajú u ľudí. Bezpečnejší je bravčový inzulín, ktorý sa líši len jednou aminokyselinou. Preto sa častejšie používa pri liečbe cukrovky.

Ľudské. Vyskytujú sa v dvoch typoch: podobné ľudskému alebo polosyntetické, získavané z bravčového inzulínu enzymatickou transformáciou a ľudské alebo rekombinantné DNA, ktoré sú produkované baktériami E. coli vďaka výdobytkom genetického inžinierstva. Tieto inzulínové prípravky sú úplne identické s hormónom produkovaným ľudským pankreasom.

V súčasnosti sa pri liečbe diabetes mellitus široko používa inzulín ľudského aj zvieracieho pôvodu. Moderná výroba živočíšneho inzulínu vyžaduje najvyšší stupeň čistenia liečiva.

To ho pomáha zbaviť sa nežiaducich nečistôt, ako je proinzulín, glukagón, somatostatín, proteíny, polypeptidy, ktoré môžu spôsobiť vážne vedľajšie účinky.

Za najlepší liek živočíšneho pôvodu sa považuje moderný monopeak inzulín, to znamená, že sa vyrába s uvoľňovaním „vrcholu“ inzulínu.

Trvanie akcie

Výroba inzulínu sa uskutočňuje pomocou rôznych technológií, čo umožňuje získať lieky s rôznym trvaním účinku, a to:

• ultrakrátka akcia;
• krátke pôsobenie;
• predĺžené pôsobenie;
• priemerné trvanie akcie;
• dlhodobo pôsobiace;
• kombinovaná akcia.

Ultra krátkodobo pôsobiace inzulíny. Tieto inzulínové prípravky sa vyznačujú tým, že začnú pôsobiť ihneď po injekcii a svoj vrchol dosiahnu po 60-90 minútach. Ich celková doba pôsobenia nie je dlhšia ako 3-4 hodiny.

Existujú dva hlavné typy ultrakrátko pôsobiaceho inzulínu – Lispro a Aspart. Inzulín Lispro sa vyrába preskupením dvoch aminokyselinových zvyškov v molekule hormónu, a to lyzínu a prolínu.

Vďaka takejto úprave molekuly je možné vyhnúť sa tvorbe hexamérov a urýchliť jej rozklad na monoméry, čo znamená zlepšenie absorpcie inzulínu. To umožňuje získať inzulínový prípravok, ktorý sa dostane do krvi pacienta trikrát rýchlejšie ako prirodzený ľudský inzulín.

Ďalším ultrakrátko pôsobiacim inzulínom je Aspart. Spôsoby výroby inzulínu Aspart sú v mnohom podobné ako pri výrobe Lispro, len v tomto prípade je prolín nahradený záporne nabitou kyselinou asparágovou.

Rovnako ako Lispro, aj Aspart sa rýchlo rozkladá na monoméry, a preto sa takmer okamžite vstrebáva do krvi. Všetky ultrakrátkodobo pôsobiace inzulínové prípravky sa môžu podávať bezprostredne pred jedlom alebo bezprostredne po jedle.

Krátkodobo pôsobiace inzulíny. Tieto inzulíny sú pufrovacie roztoky s neutrálnym pH (6,6 až 8,0). Odporúča sa ich podávať ako, ale ak je to potrebné, je povolené použiť intramuskulárne injekcie alebo kvapkadlá.

Tieto inzulínové lieky začnú pôsobiť do 20 minút po vstupe do tela. Ich účinok trvá pomerne krátko – nie viac ako 6 hodín a maximum dosahuje po 2 hodinách.

Krátkodobo pôsobiace inzulíny sa vyrábajú najmä na liečbu pacientov s diabetes mellitus v nemocničnom prostredí. Účinne pomáhajú pacientom s diabetickou kómou a kómou. Okrem toho vám umožňujú najpresnejšie určiť potrebnú dávku inzulínu pre pacienta.

Stredne pôsobiace inzulíny. Tieto lieky sa rozpúšťajú oveľa horšie ako krátkodobo pôsobiace inzulíny. Preto prúdia krv pomalšie, čo výrazne zvyšuje ich hypoglykemický účinok.

Získanie inzulínu s priemerným trvaním účinku sa dosiahne zavedením špeciálneho predlžovača do ich zloženia - zinku alebo protamínu (izofán, protafán, bazál).

Takéto inzulínové prípravky sú dostupné vo forme suspenzií, s určitým množstvom kryštálov zinku alebo protamínu (najčastejšie protamín a izofán Hagedorn). Prolongátory výrazne predlžujú dobu absorpcie liečiva z podkožného tkaniva, čo výrazne zvyšuje čas vstupu inzulínu do krvi.

Dlhodobo pôsobiace inzulíny. Ide o najmodernejší inzulín, ktorého výroba bola možná vďaka vývoju technológie rekombinantnej DNA. Úplne prvým dlhodobo pôsobiacim inzulínovým liekom bol glargín, čo je presný analóg hormónu produkovaného ľudským pankreasom.

Na jeho získanie sa uskutočňuje komplexná modifikácia molekuly inzulínu, ktorá zahŕňa nahradenie asparagínu glycínom a následné pridanie dvoch zvyškov arginínu.

Glargin je dostupný vo forme číreho roztoku s charakteristickým kyslým pH 4. Toto pH robí inzulínové hexaméry stabilnejšími a tým zabezpečuje dlhodobú a predvídateľnú absorpciu lieku do krvi pacienta. Vzhľadom na kyslé pH Glarginu sa však neodporúča kombinovať s krátkodobo pôsobiacimi inzulínmi, ktoré majú zvyčajne neutrálne pH.

Väčšina inzulínových liekov má takzvaný „vrcholový účinok“, pri ktorom je najvyššia koncentrácia inzulínu pozorovaná v krvi pacienta. Hlavnou črtou Glarginu je však to, že nemá jasný vrchol účinku.

Len jedna injekcia lieku denne postačuje na to, aby pacientovi poskytla spoľahlivú kontrolu glykémie bez vrcholov počas nasledujúcich 24 hodín. Dosahuje sa to vďaka skutočnosti, že glargín sa absorbuje z podkožného tkaniva rovnakou rýchlosťou počas celého obdobia účinku.

Inzulínové prípravky s dlhodobým účinkom sa vyrábajú v rôznych formách a dokážu pacientovi zabezpečiť hypoglykemický efekt až 36 hodín v kuse. To pomáha výrazne znížiť počet injekcií inzulínu za deň a tým výrazne uľahčiť život diabetikom.

Kombinované lieky. Tieto lieky sú dostupné vo forme suspenzie, ktorá obsahuje neutrálny roztok krátkodobo pôsobiaceho inzulínu a strednodobo pôsobiace inzulíny s izofánom.

Takéto lieky umožňujú pacientovi zaviesť do tela inzulíny s rôznym trvaním účinku iba jednou injekciou, čo znamená vyhnúť sa ďalším injekciám.

Dezinfekcia inzulínových prípravkov má veľký význam pre bezpečnosť pacienta, pretože sa vstrekujú do jeho tela a šíria sa krvným obehom do všetkých vnútorných orgánov a tkanív.

Niektoré látky, ktoré sa do inzulínu pridávajú nielen ako dezinfekčný prostriedok, ale aj ako konzervačné látky, majú určitý baktericídny účinok. Patria sem krezol, fenol a metylparabenzoát. Okrem toho je výrazný antimikrobiálny účinok charakteristický aj pre ióny zinku, ktoré sú súčasťou niektorých inzulínových roztokov.

Viacúrovňová ochrana proti bakteriálnej infekcii, ktorá sa dosahuje pridaním konzervačných látok a iných antiseptík, pomáha predchádzať vzniku mnohých závažných komplikácií. Opakované vkladanie ihly injekčnej striekačky do injekčnej liekovky s inzulínom by totiž mohlo spôsobiť kontamináciu lieku patogénnymi baktériami.

Baktericídne vlastnosti roztoku však pomáhajú ničiť škodlivé mikroorganizmy a zachovávajú jeho bezpečnosť pre pacienta. Z tohto dôvodu môžu diabetici použiť tú istú injekčnú striekačku na subkutánne injekcie inzulínu až 7-krát za sebou.

Ďalšou výhodou konzervačných látok v inzulíne je, že nie je potrebné dezinfikovať pokožku pred injekciou. Ale to je možné len s použitím špeciálnych inzulínových striekačiek vybavených veľmi tenkou ihlou.

Je potrebné zdôrazniť, že prítomnosť konzervačných látok v inzulíne nemá negatívny vplyv na vlastnosti lieku a je pre pacienta úplne bezpečná.

Záver

Dnes sa inzulín, produkovaný pomocou pankreasu zvierat a moderných metód genetického inžinierstva, široko používa na výrobu veľkého množstva liekov.

Pre dennú inzulínovú terapiu sú najvýhodnejšie vysoko purifikované DNA-rekombinantné ľudské inzulíny, ktoré sa vyznačujú najnižšou antigenicitou, a preto prakticky nevyvolávajú alergické reakcie. Okrem toho sú lieky vytvorené na základe analógov ľudského inzulínu vysoko kvalitné a bezpečné.

Inzulínové prípravky sa predávajú v sklenených fľašiach rôznych objemov, hermeticky uzavreté gumovými zátkami a pokryté hliníkovou výstelkou. Okrem toho je možné ich zakúpiť v špeciálnych inzulínových striekačkách, ako aj v injekčných perách, ktoré sú obzvlášť vhodné pre deti.

V súčasnosti sa vyvíjajú zásadne nové formy inzulínových prípravkov, ktoré sa do tela dostanú intranazálne, teda cez nosnú sliznicu.

Zistilo sa, že spojením inzulínu s detergentom je možné vytvoriť aerosólový prípravok, ktorý dosiahne požadovanú koncentráciu v krvi pacienta tak rýchlo ako pri intravenóznej injekcii. Okrem toho sa vytvárajú nové perorálne inzulínové prípravky, ktoré možno užívať ústami.

K dnešnému dňu sú tieto typy inzulínov stále buď v štádiu vývoja, alebo prechádzajú potrebnými klinickými testami. Je však jasné, že v blízkej budúcnosti sa objavia inzulínové prípravky, ktoré nebude potrebné podávať injekčnými striekačkami.

Najnovšie inzulínové produkty sa budú vyrábať vo forme sprejov, ktoré stačí nastriekať na sliznicu nosa alebo úst, aby sa úplne uspokojila potreba inzulínu v tele.

Inzulín je hlavným liekom na liečbu pacientov s cukrovkou 1. typu. Niekedy sa používa aj na stabilizáciu stavu pacienta a zlepšenie jeho pohody pri druhom type ochorenia. Táto látka je svojou povahou hormón, ktorý môže v malých dávkach ovplyvniť metabolizmus uhľohydrátov.

Za normálnych okolností pankreas produkuje dostatočné množstvo inzulínu, ktorý pomáha udržiavať fyziologickú hladinu cukru v krvi. Ale v prípade závažných endokrinných porúch je často jedinou šancou pomôcť pacientovi injekcie inzulínu. Žiaľ, nemožno ho užívať perorálne (vo forme tabliet), pretože sa v tráviacom trakte úplne zničí a stráca svoju biologickú hodnotu.

Možnosti získania inzulínu na použitie v lekárskej praxi

Nejedného diabetika zrejme aspoň raz napadlo, z čoho sa vyrába inzulín, ktorý sa používa na medicínske účely? V súčasnosti sa tento liek najčastejšie získava pomocou genetického inžinierstva a biotechnológie, niekedy sa však získava zo surovín živočíšneho pôvodu.

Prípravky získané zo surovín živočíšneho pôvodu

Extrakcia tohto hormónu z pankreasu ošípaných a hovädzieho dobytka je stará technológia, ktorá sa dnes používa len zriedka. Je to spôsobené nízkou kvalitou výsledného lieku, jeho sklonom k ​​alergickým reakciám a nedostatočným stupňom čistenia. Faktom je, že keďže hormón je bielkovinová látka, pozostáva z určitého súboru aminokyselín.

Inzulín produkovaný v tele ošípaných sa líši v zložení aminokyselín od ľudského inzulínu o 1 aminokyselinu a od hovädzieho o 3.

Na začiatku a v polovici 20. storočia, keď podobné lieky neexistovali, sa aj takýto inzulín stal prelomovým v medicíne a umožnil posunúť liečbu diabetikov na novú úroveň. Hormóny získané touto metódou znižovali hladinu cukru v krvi, často však spôsobovali vedľajšie účinky a alergie. Rozdiely v zložení aminokyselín a nečistôt v lieku ovplyvnili stav pacientov, najmä u zraniteľnejších kategórií pacientov (deti a starší ľudia). Ďalším dôvodom zlej znášanlivosti takéhoto inzulínu je prítomnosť jeho neaktívneho prekurzora v lieku (proinzulínu), ktorého sa v tejto variácii lieku nedalo zbaviť.

V dnešnej dobe existujú vylepšené bravčové inzulíny, ktoré tieto nevýhody nemajú. Získavajú sa z pankreasu ošípaných, ale potom podliehajú ďalšiemu spracovaniu a čisteniu. Sú viaczložkové a obsahujú pomocné látky.

Modifikovaný bravčový inzulín sa prakticky nelíši od ľudského hormónu, a preto sa v praxi stále používa

Takéto lieky sú pacientmi oveľa lepšie tolerované a prakticky nespôsobujú nežiaduce reakcie, nepotláčajú imunitný systém a účinne znižujú hladinu cukru v krvi. Hovädzí inzulín sa v súčasnosti v medicíne nepoužíva, pretože vďaka svojej cudzej štruktúre negatívne ovplyvňuje imunitný a iné systémy ľudského tela.

Geneticky upravený inzulín

Ľudský inzulín, ktorý sa používa pre diabetikov, sa komerčne vyrába dvoma spôsobmi:

• pomocou enzymatickej liečby bravčového inzulínu;
• pomocou geneticky modifikovaných kmeňov E. coli alebo kvasiniek.

S fyzikálno-chemickou zmenou sa molekuly bravčového inzulínu pod vplyvom špeciálnych enzýmov stávajú identickými s ľudským inzulínom. Aminokyselinové zloženie výsledného liečiva sa nelíši od zloženia prirodzeného hormónu, ktorý sa tvorí v ľudskom tele. Počas výrobného procesu je liek vysoko čistený, takže nespôsobuje alergické reakcie ani iné nežiaduce prejavy.

Ale najčastejšie sa inzulín získava pomocou modifikovaných (geneticky zmenených) mikroorganizmov. Baktérie alebo kvasinky boli biotechnologicky upravené tak, aby si mohli produkovať vlastný inzulín.

Okrem samotnej produkcie inzulínu zohráva dôležitú úlohu jeho čistenie. Aby sa zabezpečilo, že liek nespôsobí žiadne alergické alebo zápalové reakcie, v každom štádiu je potrebné sledovať čistotu kmeňov mikroorganizmov a všetkých roztokov, ako aj použité zložky.

Existujú 2 spôsoby výroby inzulínu týmto spôsobom. Prvý z nich je založený na použití dvoch rôznych kmeňov (druhov) jedného mikroorganizmu. Každý z nich syntetizuje len jeden reťazec molekuly DNA hormónu (celkom sú dva a sú spolu špirálovito stočené). Potom sa tieto reťazce spoja a vo výslednom roztoku je už možné oddeliť aktívne formy inzulínu od tých, ktoré nemajú biologický význam.

Druhý spôsob výroby lieku pomocou E. coli alebo kvasiniek je založený na skutočnosti, že mikrób najskôr produkuje neaktívny inzulín (teda jeho prekurzor - proinzulín). Potom sa pomocou enzymatickej liečby táto forma aktivuje a využíva v medicíne.

Personál, ktorý má prístup do určitých výrobných priestorov, musí vždy nosiť sterilný ochranný odev, čím sa zabráni kontaktu lieku s ľudskými biologickými tekutinami

Všetky tieto procesy sú zvyčajne automatizované, vzduch a všetky povrchy, ktoré sú v kontakte s ampulkami a liekovkami, sú sterilné a linky zariadenia sú hermeticky uzavreté.

Biotechnologické techniky umožňujú vedcom premýšľať o alternatívnych riešeniach problému cukrovky. V súčasnosti napríklad prebieha predklinický výskum výroby umelých beta buniek pankreasu, ktoré je možné získať metódami genetického inžinierstva. Možno sa v budúcnosti využijú na zlepšenie fungovania tohto orgánu u chorého človeka.

Výroba moderných inzulínových prípravkov je zložitý technologický proces, ktorý zahŕňa automatizáciu a minimálny zásah človeka

Ďalšie komponenty

Výrobu inzulínu bez pomocných látok je v modernom svete takmer nemožné si predstaviť, pretože dokážu zlepšiť jeho chemické vlastnosti, predĺžiť dobu pôsobenia a dosiahnuť vysoký stupeň čistoty.

Podľa ich vlastností možno všetky ďalšie zložky rozdeliť do nasledujúcich tried:

• predlžovače (látky, ktoré sa používajú na zabezpečenie dlhšieho účinku lieku);
• dezinfekčné zložky;
• stabilizátory, vďaka ktorým sa v roztoku liečiva udržiava optimálna kyslosť.

Predlžujúce prísady

Existujú inzulíny s predĺženým účinkom, ktorých biologická aktivita trvá 8 až 42 hodín (v závislosti od skupiny liekov). Tento účinok sa dosiahne pridaním špeciálnych látok - prolongátorov - do injekčného roztoku. Na tento účel sa najčastejšie používa jedna z týchto zlúčenín:

• proteíny;
• soli chloridu zinočnatého.

Proteíny, ktoré predlžujú účinok lieku, prechádzajú podrobnou purifikáciou a sú nízkoalergénne (napríklad protamín). Soli zinku tiež nemajú negatívny vplyv na aktivitu inzulínu alebo na pohodu človeka.

Antimikrobiálne zložky

Dezinfekčné prostriedky v inzulíne sú potrebné na to, aby sa v ňom počas skladovania a používania nemnožila mikrobiálna flóra. Tieto látky sú konzervačné látky a zabezpečujú zachovanie biologickej aktivity lieku. Navyše, ak si pacient podáva hormón z jednej fľaštičky len sebe, tak mu liek môže vydržať aj niekoľko dní. Vďaka kvalitným antibakteriálnym zložkám nebude potrebné nepoužitý liek vyhadzovať z dôvodu teoretickej možnosti množenia mikróbov v roztoku.

Nasledujúce látky sa môžu použiť ako dezinfekčné zložky pri výrobe inzulínu:

• metakrezol;
• fenol;
• parabény.

Ak roztok obsahuje ióny zinku, vďaka svojim antimikrobiálnym vlastnostiam pôsobia aj ako dodatočná konzervačná látka

Na výrobu každého typu inzulínu sú vhodné určité dezinfekčné zložky. Ich interakcia s hormónom sa musí skúmať v štádiu predklinických skúšok, pretože konzervačná látka by nemala narúšať biologickú aktivitu inzulínu ani inak negatívne ovplyvňovať jeho vlastnosti.

Použitie konzervačných látok vo väčšine prípadov umožňuje podávanie hormónu pod kožu bez predbežného ošetrenia alkoholom alebo inými antiseptikmi (výrobca to zvyčajne uvádza v pokynoch). To zjednodušuje podávanie lieku a znižuje počet prípravných manipulácií pred samotnou injekciou. Toto odporúčanie však funguje iba vtedy, ak sa roztok podáva pomocou individuálnej inzulínovej striekačky s tenkou ihlou.

Stabilizátory

Stabilizátory sú potrebné na zabezpečenie udržania pH roztoku na danej úrovni. Bezpečnosť lieku, jeho aktivita a stabilita jeho chemických vlastností závisí od úrovne kyslosti. Pri výrobe injekčných hormónov pre diabetických pacientov sa na tento účel zvyčajne používajú fosfáty.

Pre inzulíny so zinkom nie sú vždy potrebné stabilizátory roztoku, pretože kovové ióny pomáhajú udržiavať potrebnú rovnováhu. Ak sa napriek tomu použijú, potom sa namiesto fosfátov použijú iné chemické zlúčeniny, pretože kombinácia týchto látok vedie k zrážaniu a nevhodnosti lieku. Dôležitou vlastnosťou všetkých stabilizátorov je bezpečnosť a absencia schopnosti vstúpiť do akýchkoľvek reakcií s inzulínom.

Výber injekčných liekov na diabetes pre každého jednotlivého pacienta by mal vykonávať príslušný endokrinológ. Úlohou inzulínu je nielen udržiavať normálnu hladinu cukru v krvi, ale tiež nepoškodzovať iné orgány a systémy. Liek musí byť chemicky neutrálny, nízkoalergénny a pokiaľ možno cenovo dostupný. Je tiež celkom vhodné, ak sa vybraný inzulín môže miešať s jeho inými verziami na základe dĺžky pôsobenia.

Odoslanie dobrej práce do databázy znalostí je jednoduché. Použite nižšie uvedený formulár

Študenti, postgraduálni študenti, mladí vedci, ktorí pri štúdiu a práci využívajú vedomostnú základňu, vám budú veľmi vďační.

Uverejnené dňa http://www.allbest.ru/

Uverejnené dňa http://www.allbest.ru/

Uverejnené dňa http://www.allbest.ru/

MINISTERSTVO ŠKOLSTVA A VEDY REPUBLIKY KAZACHSTAN

KAZACHSKÁ AGROTECHNICKÁ UNIVERZITA POMENOVANÁ PO S.SEIFULLINOVI

Katedra mikrobiológie a biotechnológie

KURZOVÁ PRÁCA

V disciplíne "Biotechnológia mikroorganizmov"

Na tému: Technológia výroby inzulínu

Doplnil: Myrzabek M?ldir Kurbanbek?yzy

Skontroloval: Akimbaeva A.K. (Ph.D.)

Astana - 2013

DEFINÍCIE

SKRATKY A OZNAČENIA

ÚVOD

1. História objavovania

2. Výroba inzulínu v biotechnológiách

3. Spôsoby získania ľudského inzulínu

4. Expresia proinzulínu v bunkách E.coli

5. Čistenie inzulínu

6. Spôsob podávania a dávkovanie

ZÁVER

BIBLIOGRAFIA

DEFINÍCIE

V tejto práci na kurze boli použité nasledujúce definície:

Proteínový nosič- zabezpečenie transportu hybridného proteínu do periplazmatického priestoru bunky alebo kultivačného média;

Afinitná zložka výrazne uľahčuje izoláciu hybridného proteínu.

inzulín(z lat. ostrovček- ostrovček) je peptidový hormón produkovaný v beta bunkách Langerhansových ostrovčekov v pankrease.

interleukíny- skupina cytokínov syntetizovaných hlavne leukocytmi (z tohto dôvodu bola zvolená koncovka „-leukín“).

Proinzulín je prekurzor inzulínu syntetizovaný B bunkami ostrovčekového aparátu pankreasu.

Chromatogr A fiya(z gréckeho chroma, chromatos - farba, farba) , fyzikálno-chemická metóda na separáciu a analýzu zmesí, založená na rozdelení ich zložiek medzi dve fázy - stacionárnu a mobilnú (eluent) pretekajúcu cez stacionárnu fázu.

Zapuzdrenie

Hybridný proteín(Angličtina) fúzny proteín, tiež chimérický, kompozitný proteín) je proteín získaný spojením dvoch alebo viacerých génov, ktoré pôvodne kódovali samostatné proteíny.

Gorm O nás(z gréckeho hormao – dávam do pohybu, povzbudzujem), hormóny, biologicky aktívne látky produkované žľazami s vnútornou sekréciou, čiže žľazami s vnútornou sekréciou a uvoľňujúce sa priamo do krvi.

Cukorcukrovka- skupina endokrinných ochorení, ktoré vznikajú v dôsledku absolútneho alebo relatívneho nedostatku hormónu inzulínu.

Zapuzdrenie- mechanizmus programovacieho jazyka, ktorý obmedzuje prístup ku komponentom, ktoré tvoria objekt (metódy a vlastnosti), čím ich robí súkromnými, to znamená, že sú prístupné iba v rámci objektu.

somatostatín- hormón delta buniek Langerhansových ostrovčekov pankreasu, ako aj jeden z hormónov hypotalamu.

Rádioimunoanalýza- metóda kvantitatívneho stanovenia biologicky aktívnych látok (hormónov, enzýmov, liečiv a pod.) v biologických tekutinách, založená na kompetitívnej väzbe požadovaných stabilných a podobných rádionuklidom značených látok so špecifickými väzbovými systémami.

SKRATKY A OZNAČENIA

% - percentuálny obsah

RP - obrátená fáza

HPLC - vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

IO - výmena iónov

cDNA - komplementárna deoxyribonukleová kyselina

MP monopeak

MC - monokomponentný

FITC - fenylizotiokyanát

ÚVOD

Hlavnou funkciou inzulínu je zabezpečiť priepustnosť bunkových membrán pre molekuly glukózy. Zjednodušene možno povedať, že nielen sacharidy, ale aj všetky živiny sa v konečnom dôsledku štiepia na glukózu, ktorá sa používa na syntézu ďalších molekúl obsahujúcich uhlík a je jediným druhom paliva pre bunkové energetické rastliny – mitochondrie. . Bez inzulínu klesá priepustnosť bunkovej membrány pre glukózu 20-krát a bunky zomierajú od hladu a prebytočný cukor rozpustený v krvi otrávi telo.

Zhoršená sekrécia inzulínu v dôsledku deštrukcie beta buniek – absolútny nedostatok inzulínu – je kľúčovým prvkom v patogenéze diabetes mellitus 1. typu. Významnú úlohu pri vzniku diabetes mellitus 2. typu zohráva zhoršené pôsobenie inzulínu na tkanivo – relatívny nedostatok inzulínu.

Použitie afinitnej chromatografie výrazne znížilo obsah kontaminujúcich proteínov v prípravku s vyššou molekulovou hmotnosťou ako inzulín. Tieto proteíny zahŕňajú proinzulín a čiastočne štiepené proinzulíny, ktoré sú schopné vyvolať produkciu anti-inzulínových protilátok.

Používanie ľudského inzulínu od samého začiatku liečby minimalizuje výskyt alergických reakcií. Ľudský inzulín sa absorbuje rýchlejšie a bez ohľadu na zloženie má kratšiu dobu účinku ako zvieracie inzulíny. Ľudské inzulíny sú menej imunogénne ako bravčové inzulíny, najmä zmiešané hovädzie a prasacie inzulíny.

Cieľom tejto práce v kurze je študovať technológiu výroby inzulínu. Na dosiahnutie tohto cieľa boli stanovené tieto úlohy:

1.produkcia inzulínu v biotechnológii

2. spôsoby získavania inzulínu

H. čistenie inzulínu

1. História objavovania

História objavu inzulínu je spojená s menom ruského lekára I.M. Sobolev (2. polovica 19. storočia), ktorý dokázal, že hladinu cukru v krvi človeka reguluje špeciálny hormón pankreasu.

V roku 1922 bol inzulín izolovaný z pankreasu zvieraťa prvýkrát podaný desaťročnému chlapcovi s cukrovkou; výsledok prekonal všetky očakávania a o rok neskôr americká spoločnosť Eli Lilly uvoľnil prvý zvierací inzulínový prípravok.

Po prijatí prvej priemyselnej šarže inzulínu sa v priebehu niekoľkých nasledujúcich rokov uberala obrovská cesta v jeho izolácii a čistení. V dôsledku toho sa hormón stal dostupným pre pacientov s cukrovkou 1. typu.

V roku 1935 dánsky výskumník Hagedorn optimalizoval pôsobenie inzulínu v tele návrhom dlhodobo pôsobiaceho lieku.

Prvé kryštály inzulínu boli získané v roku 1952 a v roku 1954 anglický biochemik G. Sanger rozlúštil štruktúru inzulínu. Vývoj metód na čistenie hormónu od iných hormonálnych látok a produktov degradácie inzulínu umožnil získať homogénny inzulín, nazývaný jednozložkový inzulín.

Začiatkom 70. rokov. Sovietski vedci A. Yudaev a S. Shvachkin navrhli chemickú syntézu inzulínu, ale implementácia tejto syntézy v priemyselnom meradle bola drahá a nerentabilná.

Následne došlo k progresívnemu zlepšeniu čistoty inzulínu, čo znížilo problémy spôsobené inzulínovými alergiami, poruchami obličiek, zrakovým postihnutím a imunitnou rezistenciou na inzulín. Bol potrebný najúčinnejší hormón na substitučnú liečbu diabetes mellitus – homológny inzulín, teda ľudský inzulín.

V 80. rokoch pokrok v molekulárnej biológii umožnil syntetizovať pomocou E.coli oba reťazce ľudského inzulínu, ktoré sa potom spojili do molekuly biologicky aktívneho hormónu, a rekombinantný inzulín sa získal v Ústave bioorganickej chémie Ruskej akadémie vied pomocou geneticky upravených kmeňov E.coli.

2 . Výroba inzulínu v biotechnológiách

Inzulín, peptidový hormón z Langerhansových ostrovčekov pankreasu, je hlavnou liečbou diabetes mellitus. Toto ochorenie je spôsobené nedostatkom inzulínu a prejavuje sa zvýšením hladiny glukózy v krvi. Donedávna sa inzulín získaval z hovädzieho a prasačieho pankreasu. Liek sa od ľudského inzulínu líšil v 1-3 zámenách aminokyselín, takže najmä u detí hrozili alergické reakcie. Rozšírené terapeutické použitie inzulínu bolo obmedzené jeho vysokými nákladmi a obmedzenými zdrojmi. Chemickou úpravou sa inzulín zo zvierat stal na nerozoznanie od ľudského inzulínu, čo však znamenalo dodatočné zvýšenie ceny produktu.

Spoločnosť Eli Lilly od roku 1982 vyrába geneticky upravený inzulín na základe oddelenej syntézy E. kólie A - a B-reťazce. Cena produktu sa výrazne znížila, výsledný inzulín je identický s ľudským inzulínom. Od roku 1980 sa v tlači objavujú správy o klonovaní génu proinzulínu, hormonálneho prekurzora, ktorý sa transformuje do zrelej formy s obmedzenou proteolýzou.

Technológia enkapsulácie sa používa aj pri liečbe cukrovky: pankreatické bunky v kapsule, ktoré sa raz zavedú do tela pacienta, produkujú inzulín počas celého roka.

Spoločnosť Integrovaný genetika začala produkovať folikuly stimulujúce a luteinizačné hormóny. Tieto peptidy sa skladajú z dvoch podjednotiek. Na programe dňa je problematika priemyselnej syntézy oligopeptidových hormónov nervového systému - enkefalínov, zostavených z 5 aminokyselinových zvyškov, a endorfínov, analógov morfínu. Pri racionálnom použití tieto peptidy zmierňujú bolesť, vytvárajú dobrú náladu, zvyšujú výkonnosť, koncentrujú pozornosť, zlepšujú pamäť, zlepšujú spánok a bdenie. Príkladom úspešnej aplikácie metód genetického inžinierstva je syntéza p-endorfínu pomocou hybridnej proteínovej technológie opísanej vyššie pre ďalší peptidový hormón, somatostatín.

3 . Spôsoby získania ľudského inzulínu

Historicky prvým spôsobom, ako získať inzulín na terapeutické účely, je izolácia analógov tohto hormónu z prírodných zdrojov (pankreasové ostrovčeky hovädzieho dobytka a ošípaných). V 20. rokoch minulého storočia sa zistilo, že hovädzí a prasací inzulín (ktoré sú svojou štruktúrou a sekvenciou aminokyselín najbližšie ľudskému inzulínu) vykazujú v ľudskom tele aktivitu porovnateľnú s ľudským inzulínom. Potom sa hovädzí alebo bravčový inzulín dlho používal na liečbu pacientov trpiacich diabetes mellitus I. typu. Po určitom čase sa však ukázalo, že v niektorých prípadoch sa protilátky proti hovädziemu a bravčovému inzulínu začnú hromadiť v ľudskom tele, čím sa ich účinok ruší.

Na druhej strane jednou z výhod tohto spôsobu výroby inzulínu je dostupnosť surovín (hovädzí a bravčový inzulín možno ľahko získať vo veľkých množstvách), ktoré zohrali rozhodujúcu úlohu pri vývoji prvého spôsobu výroby ľudského inzulínu. inzulín. Táto metóda sa nazýva polosyntetická.

Pri tomto spôsobe výroby ľudského inzulínu bol ako východiskový materiál použitý bravčový inzulín. C-koncový oktapeptid B reťazca sa odštiepil z purifikovaného bravčového inzulínu, potom sa syntetizoval C-koncový oktapeptid ľudského inzulínu. Potom sa chemicky pridal, ochranné skupiny sa odstránili a výsledný inzulín sa čistil. Pri testovaní tohto spôsobu výroby inzulínu sa ukázalo, že výsledný hormón je úplne identický s ľudským inzulínom. Hlavnou nevýhodou tejto metódy sú vysoké náklady na výsledný inzulín (dokonca aj teraz je chemická syntéza oktapeptidu nákladným potešením, najmä v priemyselnom meradle).

V súčasnosti sa ľudský inzulín vyrába hlavne dvoma spôsobmi: modifikáciou bravčového inzulínu synteticko-enzymatickou metódou a genetickým inžinierstvom.

V prvom prípade je metóda založená na skutočnosti, že bravčový inzulín sa líši od ľudského inzulínu jednou substitúciou na C-konci B reťazca Ala30Thr. Nahradenie alanínu treonínom sa uskutočňuje enzýmovo katalyzovaným štiepením alanínu a pridaním treonínového zvyšku chráneného karboxylovou skupinou, ktorý je prítomný v reakčnej zmesi vo veľkom prebytku, namiesto. Po odštiepení ochrannej O-terc-butylovej skupiny sa získa ľudský inzulín. (obrázok 1)

Obrázok 1 - Schéma spôsobov získania ľudského inzulínu

Inzulín bol prvým komerčne vyrábaným proteínom pomocou technológie rekombinantnej DNA. Existujú dva hlavné prístupy k získaniu geneticky upraveného ľudského inzulínu. V prvom prípade sa uskutočňuje oddelená (rôzne produkčné kmene) produkcia oboch reťazcov, po ktorej nasleduje poskladanie molekuly (tvorba disulfidových mostíkov) a separácia misoforiem. V druhom sa získava vo forme prekurzora (proinzulínu), po ktorom nasleduje enzymatické štiepenie trypsínom a karboxypeptidázou. B na aktívnu formu hormónu. Najvýhodnejšou metódou v súčasnosti je získanie inzulínu vo forme prekurzora, zabezpečujúceho správne uzatvorenie disulfidových mostíkov (v prípade oddelenej výroby reťazcov sa uskutočňujú postupné cykly denaturácie, separácie misoforiem a renaturácie).

Pri oboch prístupoch je možné získať počiatočné zložky (A- a B-reťazce alebo proinzulín) samostatne alebo ako súčasť hybridných proteínov. Okrem A- a B-reťazca alebo proinzulínu môžu hybridné proteíny obsahovať:

1) nosný proteín - zabezpečujúci transport hybridného proteínu do periplazmatického priestoru bunky alebo kultivačného média;

2) afinitná zložka - výrazne uľahčujúca izoláciu hybridného proteínu.

Okrem toho môžu byť obe tieto zložky súčasne prítomné v hybridnom proteíne. Pri tvorbe hybridných proteínov sa navyše dá využiť princíp multimérie (to znamená, že v hybridnom proteíne je prítomných niekoľko kópií cieľového polypeptidu), čo môže výrazne zvýšiť výťažok cieľového produktu.

4 . Expresia proinzulínu v bunkáchE.coli

Kmeň použitý v tejto práci JM 109 N1864 s nukleotidovou sekvenciou zabudovanou do plazmidu exprimujúceho hybridný proteín, ktorý pozostáva z lineárneho proinzulínu a proteínového fragmentu pripojeného k jeho N-koncu cez metionínový zvyšok AStaphylococcus aureus. Kultivácia nasýtenej biomasy buniek rekombinantného kmeňa zabezpečuje začiatok produkcie hybridného proteínu, ktorého izolácia a následná transformácia intube viesť k inzulínu. Ďalšia skupina výskumníkov získala v bakteriálnom expresnom systéme rekombinantný fúzny proteín pozostávajúci z ľudského proinzulínu a polyhistidínového „chvostu“ pripojeného k nemu prostredníctvom metionínového zvyšku. Izoloval sa pomocou chelátovej chromatografie na Ni-agarózových kolónach z inklúznych teliesok a štiepil sa s brómkyánom. Autori určili, že izolovaný proteín bol S-sulfurizovaný. Mapovanie a hmotnostná spektrometrická analýza výsledného proinzulínu, purifikovaného iónomeničovou chromatografiou na aniónomeniči a RP (reverzná fáza) HPLC (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia), ukázala prítomnosť disulfidových mostíkov zodpovedajúcich disulfidovým mostíkom natívneho ľudského proinzulínu. Uvádza sa tiež vývoj nového, vylepšeného spôsobu výroby ľudského inzulínu pomocou metód genetického inžinierstva v prokaryotických bunkách. Autori zistili, že výsledný inzulín je štruktúrou a biologickou aktivitou identický s hormónom izolovaným z pankreasu.

V poslednej dobe sa veľká pozornosť venuje zjednodušeniu postupu na získanie rekombinantného inzulínu pomocou metód genetického inžinierstva. Takto sa získal fúzny proteín pozostávajúci z interleukínového vedúceho peptidu pripojeného k N-koncu proinzulínu cez lyzínový zvyšok. Proteín bol účinne exprimovaný a lokalizovaný v inklúznych telieskach. Po izolácii sa proteín štiepil trypsínom za vzniku inzulínu a C-peptidu. Podobne postupovala aj ďalšia skupina výskumníkov. Fúzny proteín pozostávajúci z proinzulínu a dvoch syntetických domén viažucich stafylokokový proteín A IgG, bol lokalizovaný v inklúznych telieskach, ale mal vyššiu úroveň expresie. Proteín sa izoloval afinitnou chromatografiou s použitím IgG a spracované s trypsínom a karboxypeptidázou B. Výsledný inzulín a C-peptid sa purifikovali pomocou RP HPLC. Pri vytváraní fúznych konštruktov je veľmi dôležitý hmotnostný pomer nosného proteínu a cieľového polypeptidu. Toto opisuje konštrukciu fúznych konštruktov, kde sa ako nosný polypeptid použil proteín, ktorý viaže ľudský sérový albumín. Bol naň pripojený jeden, tri a sedem C-peptidov. C-peptidy boli spojené podľa princípu „hlava-chvost“ s použitím aminokyselinových spacerov nesúcich reštrikčné miesto Sfi I a dva arginínové zvyšky na začiatku a konci spacera pre následné štiepenie proteínu trypsínom. HPLC produktov štiepenia ukázala, že štiepenie C-peptidu bolo kvantitatívne, čo umožňuje použitie multimérnych syntetických génových metód na produkciu cieľových polypeptidov v priemyselnom meradle.

Príprava proinzulínového mutantu, ktorý obsahoval substitúciu Arg32Tyr. Keď bol tento proteín spoločne štiepený trypsínom a karboxypeptidázou B, vytvorili sa natívny inzulín a C-peptid obsahujúci tyrozínový zvyšok. Ten sa po označení 125I aktívne používa v rádioimunoanalýze.

5 . Čistenie inzulínu

Inzulín určený na výrobu liekov musí mať vysokú čistotu. Preto je v každom štádiu výroby nevyhnutná vysoko účinná kontrola čistoty výsledných produktov. Predtým sa proinzulín-S-sulfonát, proinzulín, jednotlivé A- a B-reťazce a ich S-sulfonáty charakterizovali pomocou RP a IO (iónomeničovej) HPLC. Osobitná pozornosť sa venuje aj fluorescenčným derivátom inzulínu. V práci autori zisťovali použiteľnosť a výpovednú hodnotu chromatografických metód pri analýze produktov vo všetkých fázach výroby ľudského inzulínu a zostavili predpisy pre chromatografické operácie, ktoré umožňujú efektívne separovať a charakterizovať výsledné produkty. Autori separovali inzulínové deriváty pomocou bifunkčných sorbentov (hydrofóbna a iónomeničová RP HPLC) a ukázali možnosť kontroly selektivity separácie zmenou príspevku každej interakcie, čím sa dosiahla vyššia účinnosť pri separácii blízkych proteínových analógov. Okrem toho sa vyvíjajú prístupy na automatizáciu a zrýchlenie procesov určovania čistoty a množstva inzulínu. Uvádza sa výskum možnosti využitia RP kvapalinovej chromatografie s elektrochemickou detekciou na stanovenie inzulínu a bola vyvinutá metóda stanovenia inzulínu izolovaného z Langerhansovho ostrovčeka imunoafinitnou chromatografiou so spektrometrickou detekciou. Práca skúmala možnosť využitia rýchleho mikrostanovenia inzulínu pomocou kapilárnej elektroforézy s laserovou fluorescenčnou detekciou. Test sa vykonáva pridaním známeho množstva inzulínu značeného fenylizotiokyanátom (FITC) a fragmentu do vzorky. Fab monoklonálne protilátky proti inzulínu. Označené a bežné inzulíny súťažia o vytvorenie komplexu s Fab. Inzulín značený FITC a jeho komplex s Fab oddelené za 30 sekúnd.

V poslednej dobe sa veľké množstvo prác venuje zlepšovaniu metód výroby inzulínu, ako aj vytváraniu dávkových foriem na jeho základe. Napríklad v USA boli patentované hepatošpecifické inzulínové analógy, ktoré sú štrukturálne odlišné od prirodzeného hormónu v dôsledku zavedenia iných aminokyselinových zvyškov do pozícií 13 - 15 a 19 A-reťazca a do polohy 16 B. - reťaz. Získané analógy sa používajú v rôznych parenterálnych (intravenóznych, intramuskulárnych, subkutánnych), intranazálnych dávkových formách alebo implantácii vo forme špeciálnych kapsúl pri liečbe diabetes mellitus. Obzvlášť dôležité je vytvorenie dávkových foriem podávaných bez injekcií. Uvádza sa vytvorenie makromolekulárneho systému na perorálne použitie, ktorým je inzulín imobilizovaný v polymérnom hydrogéli modifikovanom inhibítormi proteolytických enzýmov. Účinnosť takéhoto liečiva je 70-80% účinnosti subkutánne podávaného natívneho inzulínu. V inej práci sa liek získava jednostupňovou inkubáciou inzulínu s červenými krvinkami odobratými v pomere 1-4:100 v prítomnosti spojiva. Autori uvádzajú získanie lieku s aktivitou 1000 jednotiek/g, s úplným zachovaním aktivity pri perorálnom podaní a skladovaní počas niekoľkých rokov v lyofilizovanej forme.

Okrem vytvárania nových liekov a liekových foriem na báze inzulínu sa vyvíjajú nové prístupy k riešeniu problému cukrovky. Takto bola transfekovaná cDNA proteínu transportéra glukózy GLUT2 bunky predtým stabilne transfekované cDNA inzulínu s plnou dĺžkou HEP G2 ins. Vo výsledných klonoch HERP G2 Insgl glukóza stimuluje takmer normálnu sekréciu inzulínu a zosilňuje sekrečnú odpoveď na iné sekretagogy. Imunoelektrónová mikroskopia odhalila v bunkách granule obsahujúce inzulín, morfologicky podobné granulám v b-bunkách Langerhansových ostrovčekov. V súčasnosti sa vážne diskutuje o možnosti využitia „umelej b-bunky“ získanej metódami genetického inžinierstva na liečbu diabetu 1. typu.

Spolu s riešením praktických problémov sa študujú aj mechanizmy účinku inzulínu, ako aj štrukturálne-funkčné vzťahy v molekule. Jednou z výskumných metód je tvorba rôznych inzulínových derivátov a štúdium ich fyzikálno-chemických a imunologických vlastností. Ako bolo uvedené vyššie, množstvo spôsobov výroby inzulínu je založených na získaní tohto hormónu vo forme prekurzora (proinzulínu), po ktorom nasleduje enzymatické štiepenie na inzulín a C-peptid. V súčasnosti sa ukázalo, že C-peptid má biologickú aktivitu, čo umožňuje jeho použitie na terapeutické účely spolu s inzulínom. Nasledujúce články tejto série budú diskutovať o fyzikálno-chemických a biologických vlastnostiach C-peptidu, ako aj o spôsoboch jeho prípravy.

Významný je aj príspevok biotechnológie k priemyselnej výrobe nepeptidových hormónov, predovšetkým steroidov. Metódy mikrobiologickej transformácie umožnili výrazne znížiť počet krokov v chemickej syntéze kortizónu, hormónu nadobličiek používaného na liečbu reumatoidnej artritídy. Pri výrobe steroidných hormónov sa vo veľkej miere využívajú imobilizované mikrobiálne bunky napr Arthrobacterglobiformis na syntézu prednizolónu z hydrokortizónu. Existuje vývoj na získanie hormónu štítnej žľazy tyroxínu z mikrorias.

Podľa stupňa čistenia

· tradičné- extrahované kyslým etanolom a počas procesu čistenia sa filtrujú, vysolujú a mnohokrát kryštalizujú (metóda neumožňuje očistiť prípravok od nečistôt iných hormónov obsiahnutých v pankrease)

· monopeak (MP) - po tradičnom čistení sú filtrované na géli (pri gélovej chromatografii tvoria iba jeden „vrchol“: obsah vyššie uvedených nečistôt nie je väčší ako 1·10?3

· Monokomponent (MC) - prechádzajú ešte hlbším prečistením pomocou metódy molekulárneho sita a iónomeničovej chromatografie DEAE-celulóza, ktorá umožňuje dosiahnuť 99% stupeň čistoty (1·10?6) (obrázok 2)

Obrázok 2 - Schéma čistenia inzulínu

biotechnológia inzulínu diabetes mellitus

6 . Návod na použitie a dávkovanie

Stanovené a regulované prísne pod lekárskym dohľadom podľa stavu pacienta. Všetky humulínové prípravky sa môžu podávať subkutánne alebo intravenózne; Humulin R v ampulkách sa podáva intravenózne. Pacienti uprednostňujú subkutánne podanie do hornej časti ramena, stehna, zadku alebo brucha. Miesta vpichu sa majú striedať tak, aby sa rovnaká časť tela používala nie viac ako raz za mesiac. V tomto prípade by kapiláry nemali byť ovplyvnené. Miesto vpichu nevyžaduje masáž. Humulinové náplne sa používajú len na injekciu v perách Becton Dickinson. V tomto prípade je potrebné pri dopĺňaní a používaní peny dôsledne dodržiavať pokyny výrobcu vyznačené na penách. Pacienti by mali mať vždy po ruke náhradnú injekčnú striekačku a ampulku Humulinu pre prípad, že by sa injekčná pomôcka Pen alebo náplň stratili. Akčné profily humulínu. Humulin R: nástup účinku po 10 minútach, maximálny účinok - medzi 1 a 3 hodinami, trvanie účinku - od 5 do 7 hodín. Humulin N: nástup účinku - po 30 minútach, maximálny účinok - medzi 2 a 8 hodinami, trvanie účinku - od 18 do 20 hodín. Humulin M1: nástup účinku - po 30 minútach, maximálny účinok - medzi 2 a 9 hodinami, trvanie účinku - od 16 do 18 hodín. Humulin M2: nástup účinku - po 30 minútach, maximálny účinok medzi 1,5 a 9 hodinami, trvanie účinku - od 14 do 16 hodín. Humulin M3: nástup účinku - po 30 minútach, maximálny účinok - medzi 1 a 8,5 hodinou, trvanie účinku - od 14 do 15 hodín. Humulin M4: nástup účinku - po 30 minútach, maximálny účinok - medzi 1 a 8 hodinami, trvanie účinku - od 14 do 15 hodín. Humulin L: nástup účinku - po 2 hodinách, maximálny účinok - medzi 4 a 16 hodinami, trvanie účinku - asi 24 hodín. Humulin U: nástup účinku - po 3 hodinách, maximálny účinok - medzi 3 a 18 hodinami, trvanie účinku - od 24 do 28 hodín. Jednolieková terapia. Humulin R sa môže podávať bez iných typov inzulínu pomocou viacerých denných injekcií. Humulin N, L a U možno podávať aj nezávisle 1-2 krát denne. Kombinovaná terapia. Na zvýšenie počiatočného účinku sa niektorým pacientom predpisujú okrem Humulinu R aj humulíny N, L a U. Súčasné použitie zvieracích inzulínov vyrábaných rôznymi spoločnosťami sa neodporúča. Humulin M nevyžaduje kombinovanú liečbu, podáva sa dvakrát denne (2/3 dennej potreby ráno, zvyšok večer). Pri akomkoľvek podaní by dávka nemala prekročiť 50 jednotiek. Pacientka je povinná informovať lekára o tehotenstve. V tomto období je nevyhnutné prísne sledovanie zdravotného stavu pacienta závislého od inzulínu. Potreba lieku zvyčajne klesá v prvom trimestri a zvyšuje sa v druhom a treťom trimestri. Pacienti s cukrovkou počas laktácie vyžadujú úpravu dávky inzulínu (a diéty).

ZÁVER

Diabetes mellitus je chronické ochorenie spôsobené absolútnym alebo relatívnym nedostatkom inzulínu. Je charakterizovaná hlbokou poruchou metabolizmu uhľohydrátov s hyperglykémiou a glykozúriou, ako aj ďalšími metabolickými poruchami vyplývajúcimi z vplyvu množstva genetických a vonkajších faktorov.

Inzulín stále slúži ako radikálny a vo väčšine prípadov jediný prostriedok na udržanie života a schopnosti pacientov s cukrovkou. Pred prijatím a zavedením inzulínu na kliniku v rokoch 1922-1923. U pacientov s diabetes mellitus I. typu došlo k úmrtiu do jedného až dvoch rokov od začiatku ochorenia, a to aj napriek používaniu tých najvysilujúcejších diét. Pacienti s diabetes mellitus I. typu vyžadujú celoživotnú substitučnú liečbu inzulínovými preparátmi. Zastavenie pravidelného podávania inzulínu z jedného alebo druhého dôvodu vedie k rýchlemu rozvoju komplikácií a rýchlej smrti pacienta.

V súčasnosti je diabetes mellitus na treťom mieste z hľadiska prevalencie po kardiovaskulárnych ochoreniach a rakovine. Podľa Svetovej zdravotníckej organizácie je prevalencia cukrovky medzi dospelými vo väčšine regiónov sveta 2 – 5 % a počet pacientov má tendenciu sa každých 15 rokov takmer zdvojnásobiť. Napriek zjavnému pokroku v oblasti zdravotnej starostlivosti sa počet pacientov závislých od inzulínu každým rokom zvyšuje a v súčasnosti len v Rusku predstavuje približne 2 milióny ľudí.

Vytvorenie domácich geneticky upravených humánnych inzulínových prípravkov otvára nové možnosti riešenia mnohých problémov na záchranu životov miliónov ľudí trpiacich cukrovkou.

Diabetes mellitus je na treťom mieste na svete po kardiovaskulárnych a rakovinových ochoreniach. Podľa rôznych zdrojov je na svete 120 až 180 miliónov ľudí s cukrovkou, čo sú 2-3 percentá z celkovej populácie planéty. Podľa vedcov sa očakáva, že každých 15 rokov sa počet chorých zdvojnásobí.

Inzulín je podľa mňa jeden z najviac skúmaných hormónov. Od objavu skutočnosti, že inzulín produkovaný pankreasom je zodpovedný za znižovanie hladiny cukru v krvi, uplynulo už viac ako 80 rokov. Napriek tomu je tento hormón dodnes veľmi zaujímavý.

BIBLIOGRAFIA

1. Re, L. Optimalizácia biotechnologickej výroby rekombinantných ľudských interferónových látok; pruhu z francúzštiny - M.: Mir, 2002.-S. 140-143.

2. Shevelukha, V. S. Agricultural biotechnology/V. S. Shevelukha, E. A. Kalašnikova, 4. vydanie - M.: Vydavateľstvo vyššej školy, 2003. - 437 s.

3. Smith, O. Štátny register liekov; pruhu z angličtiny - M.: Mir, 2003.-P. 37-39.

4. Griščenko, V. I. Molekulárna biotechnológia interferónov - 2008.-T. 11, vydanie 7.-Charkov. 238.

5. Sadchenko, L. S. Moderné výdobytky biotechnológie v medicínskom priemysle. -2008.-M. 31, vydanie 5.-L. 213.

6.Moderná biotechnológia [Elektronický zdroj]: stránka o biotechnológii. - Režim prístupu: http://www.bionews.ru/news/Bio.htm

7. Mariniva A.K. Produkcia bielkovín. Biotechnológia - 2007.-T. 51, vydanie 5.-SPb. 17.

8.http://ru.wikipedia.org/wiki/

9.http://www.medichelp.ru/

10.http://mikrobio.ho.ua/

Uverejnené na Allbest.ru

Podobné dokumenty

Zabezpečenie priepustnosti bunkových membrán pre molekuly glukózy inzulínom, hormónom peptidovej povahy. Reakcie na inzulínové lieky: imunologická inzulínová rezistencia, alergie, lipodystrofia. Získanie inzulínu, rôzne jeho prípravky.

abstrakt, pridaný 02.05.2010


História vzniku a mechanizmu účinku inzulínu, čo je proteín-peptidový hormón produkovaný bunkami Langerhansových ostrovčekov v pankrease. Spôsoby príjmu. Nevýhody zvieracieho inzulínu. Výhody biotechnologického inzulínu.

prezentácia, pridané 15.03.2016


Etiológia a patogenéza, klasifikácia diabetes mellitus, inzulínová terapia. Farmakokinetika inzulínových prípravkov, ich interakcia s inými liekmi. Transbukálne a sublingválne, inhalačné cesty dodania do ľudského tela.

práca, pridané 16.10.2014


Zlepšenie kvality života pacientov s cukrovkou. Výpočet zloženia stravy. Predpisovanie inzulínu, výpočet jeho dávky, distribúcia inzulínu počas dňa. Procesy biosyntézy a sekrécie inzulínu. Aplikácia sínusového modulovaného prúdu.

prezentácia, pridané 20.10.2014


Štúdium štruktúry a účinku inzulínu. Sekrécia a syntéza glukogónu. Štúdium symptómov a diagnostiky cukrovky. Charakteristika chorôb endokrinného systému. Použitie liekov a chemikálií pri liečbe chorôb.

prezentácia, pridané 12.10.2015


Pojem a funkcie hormónov. Mikrobiologické premeny steroidov s priemyselným využitím. Suroviny na syntézu steroidných hormónov. Metóda genetického inžinierstva na výrobu somatostatínu. Vytvorenie inzulínu na základe technológie rekombinantnej DNA.

prezentácia, pridané 22.12.2016


Vlastnosti liečby diabetes mellitus typu I. Použitie diétnej terapie, fyzickej aktivity, inzulínovej terapie. Kritériá kompenzácie diabetes mellitus. Odporúčania pre režim fyzickej aktivity. Chronické predávkovanie inzulínom (Somogyiho syndróm).

prezentácia, pridané 23.09.2016


Etiológia a klinické prejavy diabetes mellitus. Druhy inzulínu, pravidlá skladovania. Koncepcia a režimy inzulínovej terapie. Štúdia komplikácií vznikajúcich po injekcii inzulínu. Úloha sestry pri edukácii pacientov s diabetes mellitus.

kurzová práca, pridané 06.01.2016


Porušenie vnútornej sekrécie pankreasu. Vlastnosti príznakov diabetes mellitus, prípady zvýšenej hladiny inzulínu v krvi. Metódy na rozpoznanie rôznych typov hypoglykémie. Hypotézy príčin poškodenia pankreasu.

abstrakt, pridaný 28.04.2010


Hodnotenie účinnosti liečby cukrovky. Klinická a diagnostická hodnota glukózy v cerebrospinálnej tekutine. Hlavné vlastnosti glukózového tolerančného testu. Krivka po jednorazovom zaťažení glukózou. Krivka sekrécie inzulínu pre diabetes druhého stupňa.