4 mecanism de inactivare a proteinelor g. Pentru ce sunt necesare proteinele G? În plus, protein kinaza C poate fosforila subunitatea b a proteinei G purificate și in vivo proteina Gz

Din istoria descoperirii proteinelor C. 8

Structură și proprietăți. 8

Comunicarea cu membrana. 9

Organizarea structurală și funcțională a proteinelor G. 9

Clasificare în funcție de sensibilitatea la jetoane.. 10

Interfață cu sisteme efectoare. 10

Reglarea activității proteinei G. unsprezece

Adenilat ciclază. 12

Fosfolipaze.. 13

Protein kinaze.. 14

Fosfodiesteraze.. 16

Sistemul de adenil-ciclază. 17

Efectul toxinelor bacteriene asupra activității adenilat-ciclazei (ribozilarea ADP a proteinelor G) 20

Sistemul de inozitol fosfat. 21

Participarea proteinei calmodulină la transducția semnalului de inozitol fosfat. 22

Autoreglare a sistemului.. 23

subunitatea α: proprietăți generale. 23

subunitățile β și γ: caracteristici generale. 24

Proteine ​​G: subunități βγ... 25

Proteinele care leagă GTP formează două familii majore de proteine ​​G și proteine ​​​​de legare GTP cu greutate moleculară mică. 28

Literatură. treizeci

Introducere

Proteinele G de semnalizare sunt intermediari universali în transmiterea semnalelor hormonale de la receptorii membranei celulare la proteinele efectoare care provoacă răspunsul celular final. Atunci când o moleculă de receptor cu șapte domenii localizată în membrana unei celule senzoriale este activată de unele modificări ale mediului extern, aceasta suferă modificări conformaționale. Acestea din urmă sunt detectate

Proteinele G legate de membrană, care la rândul lor activează moleculele efectoare din membrană. Acest lucru duce adesea la eliberarea de mesageri secundi în citosol.

Au făcut obiectul unui studiu intens datorită implicării lor în multe procese fiziologice importante. Proteinele G implicate în transducția semnalului sunt membri ai unei mari superfamilii de proteine ​​de legare a guaninei. Proteinele G sunt regulatori de precizie care activează sau oprește activitatea altor molecule.

Aproximativ 80% dintre mesagerii primari (hormoni, neurotransmitatori, neuromodulatori) interactioneaza cu receptori specifici care sunt cuplati la efectori prin intermediul proteinelor G.

Proteinele G sunt proteine ​​care leagă nucleotidele de guanozină. Proteinele G asociate receptorilor sunt legate de membrană. Într-o stare inactivă, acestea sunt asociate cu PIB-ul. Când receptorul se leagă de un ligand, GDP este înlocuit cu GTP, ducând la activare. Acest proces este relativ lent, având loc în câteva secunde - zeci de secunde.

Proteinele G ale membranelor biologice au o structură heterotrimerică. Ele constau dintr-o subunitate α mare (aproximativ 45 kilodaltoni - kDa), precum și subunități mai mici β și γ, subunitatea α are activitate GTPază, în forma sa inactivă (deconectată) leagă molecula GDP la nivelul activ. site-ul. Subunitățile β și γ sunt interconectate și nu pot fi disociate în condiții fiziologice. În starea inactivă, complexul βγ este legat slab de subunitatea α. Subunitatea y este conectată la frunza citoplasmatică a membranei biologice printr-un lanț geranil-geranil (20 atomi de carbon în lanț), similară ca structură cu colesterolul. Subunitatea α este, de asemenea, legată de membrană de un acid gras cu catenă de 14 atomi de carbon (acid miristoic). Astfel de conexiuni asigură că complexul proteic G este menținut în planul membranei, dar în același timp este capabil să se miște cu ușurință în acest plan. Este ușor de imaginat cum întregul complex de proteine ​​G cu GDP atașat se mișcă în planul membranei sub influența forțelor termice; două familii de proteine ​​- proteine ​​de legare a nucleotidelor de guanozină heterotrimerice (proteine ​​G) și guanozin trifosfataze (GTPaze) înrudite la distanță. poate fi pornit atunci când GTP se leagă și activează componentele din aval ale transducției semnalului de suprafață celulară. GTPazele mici sunt implicate în controlul proprietăților fundamentale ale celulei - polaritatea formei și procesele de diviziune și diferențiere. Proteinele G reglează de obicei semnale mai specializate - producția de mesageri secundi. Ambele sunt capabile să hidrolice GTP-ul și astfel să oprească semnalul.

Deoarece subunitățile β și γ ale proteinelor G sunt extrem de conservate, proteinele G se disting de obicei prin subunitățile lor α. În plus față de motivul de legare a GTP, fiecare secvență Galpha conține cel puțin un situs de legare pentru cationi divalenți, precum și situsuri pentru modificarea covalentă de către toxine bacteriene care catalizează reacțiile ADP-ribosiltransferazei dependente de NAD. Proteinele G care stimulează adenilat ciclaza (Gs) sau sunt implicate în fototransducție (Gt, transducină) servesc drept substraturi pentru ADP-ribozilarea catalizată de toxina holeră la unul dintre resturile de arginină, ceea ce duce la blocarea dezactivării acestor proteine. Gs, proteina G inhibitoare a adenilat-ciclazei (Gi) și proteina G cu funcție încă necunoscută (Go) sunt ADP-ribozilate de toxina pertussis la un reziduu de cisteină situat la capătul C-terminal. Această modificare interferează cu interacțiunea dintre proteina G și receptori. A fost determinată secvența proteinei G de șobolan (Gx), care s-a dovedit a fi insensibilă la toxina pertussis.

Proteinele G sunt proteine ​​reglatoare care leagă GTP la activare. Cele mai bine studiate sunt proteinele G care stimulează și inhibă adenilat ciclaza (proteinele Gs și, respectiv, proteinele Gi). Receptorii β' - adrenergici, β2 - receptorii adrenergici și receptorii D1 sunt cuplati la proteina Gs și, prin urmare, stimularea acestor receptori este însoțită de activarea adenilat-ciclazei și de o creștere a concentrației intracelulare de cAMP - al doilea mesager (intracelular) clasic. . Răspunsul final în diferite celule este diferit și depinde de ce sunt fragmentele efectoare (enzimă, canal ionic etc.) Receptorii α2-adrenergici, receptorii M2-colinergici și receptorii D2 sunt cuplati la proteina Gi, iar stimularea acestor receptori conduce la o scădere a activității adenilat-ciclazei și a concentrației intracelulare a cAMP. Modificările în activitatea enzimelor și a altor proteine ​​intracelulare și, în consecință, funcțiile celulare sunt opuse celor observate în timpul activării proteinei Gs. Receptorii α1-adrenergici (cum ar fi receptorii colinergici M1) sunt aparent asociați cu un alt tip de proteină G, încă puțin studiat. Această proteină este uneori denumită Gq. Activează fosfolipaza C, care catalizează descompunerea fosfolipidelor membranare, în special fosfatidilinozitol-4,5-difosfat la ISP și DHA. Ambele substanțe sunt mesageri secundi.

Legarea unui agonist (hormon, neurotransmițător etc.) la receptorul corespunzător duce la interacțiunea proteină-proteină între receptor și proteina G și accelerează disocierea HDP. Ca rezultat, se formează un complex agonist-receptor-proteină G de scurtă durată care nu este asociat cu nicio nucleotidă. Legarea moleculei GTP la acest complex reduce afinitatea receptorului pentru proteina G, ceea ce duce la disocierea complexului și la eliberarea receptorului. Potenţial, receptorul poate activa un număr mare de molecule de proteină G, oferind astfel un factor mare de amplificare a semnalului extracelular în această etapă. Subunitatea α activată a proteinei G se disociază de subunitățile βγ și interacționează cu efectorul corespunzător, exercitând asupra acesteia un efect activator sau inhibitor.

Subunitatea α cu GTP atașată la ea este capabilă să interacționeze cu un efector din membrană - enzime precum adenilat ciclaza sau, eventual, canale ionice. O enzimă poate fi activată sau inhibată, iar un canal ionic se poate deschide sau închide. Exemple specifice vor fi discutate în secțiunile următoare. Interacțiunea cu efectorul, totuși, durează atâta timp cât subunitatea α, care este o GTPază, reține GTP. Deci, foarte curând GTP-ul atașat este hidrolizat la HDF. Când se întâmplă acest lucru, subunitatea α își schimbă din nou conformația și își pierde capacitatea de a activa efectorul. După aceasta, α-GDP interacționează cu complexul βγ și formează din nou un complex trimeric, completând astfel ciclul. De asemenea, se presupune că complexul de subunități βγ poate influența (direct sau indirect) și enzimele efectoare.

Astfel de enzime sunt adenilat ciclaza și fosfolipaza C. Proteinele G reglează, de asemenea, funcționarea canalelor ionice K și Ca2+. Proteinele G includ polipeptida Gs, care stimulează adenilat ciclaza și reglează canalele ionice Ca2+, polipeptida Gi, care inhibă adenilat ciclaza și reglează K+ -canale în celulele țesutului cerebral, Gt, transducina, implicate în transmiterea semnalului luminos, proteina specifică Golf a cililor olfactiv etc. Toate proteinele G sunt heterotrimeri, formate din subunități α, β‚ și γ în ordinea greutății moleculare descrescătoare.

Ulterior, GTP legat de subunitatea α a proteinei G suferă hidroliză, iar enzima care catalizează acest proces este subunitatea α însăși. Aceasta duce la disocierea subunității α de efector și la reasociere a complexului α-GDP cu subunitățile βγ. Activarea spontană a proteinei G asociată cu PIB este un proces foarte puțin probabil.

Același mecanism stă la baza reglării hormonale a fosfolipazei C și fosfolipazei A2 specifice fosfoinozitidei. În plus, s-a demonstrat că proteinele G pot activa direct canalele ionice.

Etapa de limitare a vitezei în procesul de restabilire a stării inițiale a proteinei G este viteza de disociere a GDP de subunitatea α a proteinei G. Rata de disociere crește atunci când proteina G-GDP interacționează cu receptorul legat de agonist. Legarea GTP de către proteina G duce aparent la formarea unui complex agonist-receptor-proteină G. Analogul GTP-STP-γ-S și Mg2+ îmbunătățește disocierea subunității α de trimerul proteinei G. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că subunitatea catalitică a adenilat-ciclazei din membranele creierului bovin este co-purificată cromatografic cu subunitățile α și β ale proteinei Gs și problema disocierii subunităților α din trimerul proteinei G. pentru a activa efectorul necesită clarificare.

Proteinele G prezintă un polimorfism semnificativ. Fiecare formă de subunități de proteină G este foarte omoloagă ca structură, similară ca funcție, dar diferă în ceea ce privește greutatea moleculară și mobilitatea electroforetică. Polimorfismul este deosebit de larg și a fost cel mai studiat pentru proteinele αs și αiG. Astfel, din creierul uman au fost izolate 11 forme de ADN responsabile de sinteza subunităților αs, dintre care patru tipuri au fost donate și se presupune că determină sinteza a patru izoforme αs în creierul uman. Pentru αi s-au găsit în principal trei izoforme: αi1, αi2, αi3. Masele moleculare ale izoformei αs sunt în intervalul 42-55 kDa și αi 39-41 kDa. Distribuția variantelor moleculare ale αi este specifică țesutului: αi1 este prezent în principal în creier, αi2 se găsește în țesutul nervos și celulele sanguine, αi3 este prezent în țesuturile periferice și este absent în creier. Distribuția genelor care codifică sinteza celor trei izoforme αi în țesuturi coincide aproximativ în următoarea ordine: om, bovin, șobolan, șoarece. Determinarea secvenței de aminoacizi a αi și αs a arătat că izoformele αs sau αi diferă în regiunea secvențelor C- și N-terminale care se leagă la receptor sau efector. Se presupune că polimorfismul subunităților α este determinat de diversitatea receptorilor și subtipurile acestora și de diversitatea sistemelor efectoare.

Numele „veverițe” provine de la capacitatea multora dintre ele de a deveni albi atunci când sunt încălzite. Denumirea „proteine” provine din cuvântul grecesc pentru „întâi”, indicând importanța lor în organism. Cu cât nivelul de organizare al ființelor vii este mai mare, cu atât compoziția proteinelor este mai diversă.

Proteinele sunt formate din aminoacizi, care sunt legați între ele prin legături covalente. peptidă legătură: între gruparea carboxil a unui aminoacid și gruparea amino a altuia. Când doi aminoacizi interacționează, se formează o dipeptidă (din resturile a doi aminoacizi, din greacă. peptos- gătit). Înlocuirea, excluderea sau rearanjarea aminoacizilor într-un lanț polipeptidic determină apariția de noi proteine. De exemplu, la înlocuirea unui singur aminoacid (glutamină cu valină), apare o boală gravă - anemia secerată, când globulele roșii au o formă diferită și nu își pot îndeplini funcțiile principale (transportul oxigenului). Când se formează o legătură peptidică, o moleculă de apă se desprinde. În funcție de numărul de reziduuri de aminoacizi, acestea se disting:

– oligopeptide (di-, tri-, tetrapeptide etc.) – conțin până la 20 de resturi de aminoacizi;

– polipeptide – de la 20 la 50 de resturi de aminoacizi;

– veverite – peste 50, uneori mii de reziduuri de aminoacizi

Pe baza proprietăților lor fizico-chimice, proteinele se disting între hidrofile și hidrofobe.

Există patru niveluri de organizare a moleculei proteice - structuri spațiale echivalente (configuratii, conformaţie) proteine: primare, secundare, terțiare și cuaternare.

Primar structura proteinelor este cea mai simplă. Are forma unui lanț polipeptidic, unde aminoacizii sunt legați între ei printr-o legătură peptidică puternică. Determinată de compoziția calitativă și cantitativă a aminoacizilor și de secvența acestora.

Structura secundară a proteinelor

Secundar structura este formată predominant din legături de hidrogen care s-au format între atomii de hidrogen ai grupului NH ai unei curbe de helix și atomii de oxigen ai grupului CO a celuilalt și sunt direcționați de-a lungul spiralei sau între pliurile paralele ale moleculei proteice. Molecula de proteină este parțial sau în întregime răsucită într-o α-helix sau formează o structură β-sheet. De exemplu, proteinele de keratina formează un α-helix. Ele fac parte din copite, coarne, păr, pene, unghii și gheare. Proteinele care alcătuiesc mătasea au o foaie β. Radicalii de aminoacizi (grupele R) rămân în afara helixului. Legăturile de hidrogen sunt mult mai slabe decât legăturile covalente, dar cu un număr semnificativ dintre ele formează o structură destul de puternică.

Funcționarea sub formă de spirală răsucită este caracteristică unor proteine ​​fibrilare - miozină, actină, fibrinogen, colagen etc.

Structura terțiară a proteinelor

Terţiar structura proteinelor. Această structură este constantă și unică pentru fiecare proteină. Este determinată de mărimea, polaritatea grupărilor R, forma și secvența reziduurilor de aminoacizi. Helixul polipeptidic este răsucit și pliat într-un anumit fel. Formarea structurii terțiare a unei proteine ​​duce la formarea unei configurații speciale a proteinei - globule (din latinescul globulus - minge). Formarea sa este determinată de diferite tipuri de interacțiuni necovalente: hidrofobe, hidrogen, ionice. Punți disulfură apar între resturile de aminoacizi de cisteină.

Legăturile hidrofobe sunt legături slabe între lanțurile laterale nepolare care rezultă din respingerea reciprocă a moleculelor de solvent. În acest caz, proteina se răsucește astfel încât lanțurile laterale hidrofobe sunt scufundate adânc în interiorul moleculei și o protejează de interacțiunea cu apa, în timp ce lanțurile laterale hidrofile sunt situate în exterior.

Majoritatea proteinelor au o structură terțiară - globuline, albumine etc.

Structura proteinelor cuaternare

Cuaternar structura proteinelor. Formată ca rezultat al combinației de lanțuri polipeptidice individuale. Împreună formează o unitate funcțională. Există diferite tipuri de legături: hidrofobe, hidrogen, electrostatice, ionice.

Legăturile electrostatice apar între radicalii electronegativi și electropozitivi ai reziduurilor de aminoacizi.

Unele proteine ​​sunt caracterizate printr-un aranjament globular al subunităților - aceasta este globular proteine. Proteinele globulare se dizolvă ușor în apă sau soluții sărate. Peste 1000 de enzime cunoscute aparțin proteinelor globulare. Proteinele globulare includ unii hormoni, anticorpi și proteine ​​de transport. De exemplu, molecula complexă de hemoglobină (proteina globulelor roșii) este o proteină globulară și constă din patru macromolecule de globină: două lanțuri α și două lanțuri β, fiecare dintre ele conectată la hem, care conține fier.

Alte proteine ​​sunt caracterizate prin asociere în structuri elicoidale - aceasta este fibrilare (din latină fibrilla - fibră) proteine. Mai multe (3 până la 7) elice α sunt răsucite împreună, ca fibrele dintr-un cablu. Proteinele fibrilare sunt insolubile în apă.

Proteinele sunt împărțite în simple și complexe.

Proteine ​​simple (proteine)

Proteine ​​simple (proteine) constau numai din reziduuri de aminoacizi. Proteinele simple includ globuline, albumine, gluteline, prolamine, protamine, pistoane. Albuminele (de exemplu, albumina serică) sunt solubile în apă, globulinele (de exemplu, anticorpii) sunt insolubile în apă, dar solubile în soluții apoase ale anumitor săruri (clorura de sodiu etc.).

Proteine ​​complexe (proteide)

Proteine ​​complexe (proteide) includ, pe lângă reziduurile de aminoacizi, compuși de altă natură, care se numesc protetice grup. De exemplu, metaloproteinele sunt proteine ​​care conțin fier non-hem sau legate prin atomi de metal (majoritatea enzimelor), nucleoproteinele sunt proteine ​​legate de acizi nucleici (cromozomi etc.), fosfoproteinele sunt proteine ​​care conțin resturi de acid fosforic (proteine ​​de ou, gălbenuș etc.). ), glicoproteine ​​- proteine ​​combinate cu carbohidrați (unii hormoni, anticorpi etc.), cromoproteine ​​- proteine ​​care conțin pigmenți (mioglobină etc.), lipoproteine ​​- proteine ​​care conțin lipide (incluse în compoziția membranelor).

Proteinele G de semnalizare sunt intermediari universali în transmiterea semnalelor hormonale de la receptorii membranei celulare la proteinele efectoare care provoacă răspunsul celular final.

Ele fac obiectul unui studiu intens datorită participării lor la multe procese fiziologice importante (vezi recenziile lui Gilman, 1987; Neer, Clapham, 1988; Freissmuth et al., 1989, Kuhar V.P. ea, 1992). Proteinele G implicate în transducția semnalului sunt membri ai unei mari superfamilii de proteine ​​de legare a guaninei. Proteinele G sunt regulatori de precizie care activează sau oprește activitatea altor molecule.

Legarea unui agonist (hormon, neurotransmițător etc.) la receptorul corespunzător duce la interacțiunea proteină-proteină între receptor și proteina G și accelerează disocierea HDP. Ca rezultat, se formează un complex agonist-receptor-proteină G de scurtă durată care nu este asociat cu nicio nucleotidă. Legarea moleculei GTP la acest complex reduce afinitatea receptorului pentru proteina G, ceea ce duce la disocierea complexului și la eliberarea receptorului. Potenţial, receptorul poate activa un număr mare de molecule de proteină G, oferind astfel un factor mare de amplificare a semnalului extracelular în această etapă. Subunitatea alfa de proteină G activată (alfa* GTP Mg). [Bourne, ea 1997] se disociază de subunitățile beta-gamma și interacționează cu efectorul corespunzător, exercitând asupra acestuia un efect activator sau inhibitor.

Subunitatea alfa cu GTP atașat la ea este capabilă să interacționeze cu un efector din membrană - enzime precum adenilat ciclaza, sau eventual canale ionice. O enzimă poate fi activată sau inhibată, iar un canal ionic se poate deschide sau închide. Exemple specifice vor fi discutate în capitolele următoare. Interacțiunea cu efectorul, totuși, durează atâta timp cât subunitatea alfa, care este o GTPază, reține GTP. Deci, foarte curând GTP-ul atașat este hidrolizat la HDF. Când se întâmplă acest lucru, subunitatea alfa își schimbă din nou coformarea și își pierde capacitatea de a activa efectorul. După aceasta, alfa-GDP interacționează cu complexul beta-gamma și formează din nou un complex trimeric, completând astfel ciclul (Fig. 1.9). De asemenea, se presupune că complexul de subunități beta-gamma poate influența (direct sau indirect) și enzimele efectoare.

Ulterior, GTP legat de subunitatea alfa a proteinei G suferă hidroliză, iar enzima care catalizează acest proces este subunitatea alfa însăși. Aceasta are ca rezultat disocierea subunității alfa de efector și reasocierea complexului alfaGDP cu subunitățile beta-gamma. Activarea spontană a proteinei G asociată cu PIB este un proces foarte puțin probabil.

Același mecanism stă la baza reglării hormonale a fosfolipazei C specifice fosfoinozitidei (Boyer și colab., 1989) și a fosfolipazei A2 (Axelrod și colab., 1988). În plus, s-a demonstrat că proteinele G pot activa direct canalele ionice (Sternweis și Pang, 1990). Vezi si:

Etapa de limitare a vitezei în procesul de restabilire a stării inițiale a proteinei G este rata de disociere a PIB-ului de subunitatea alfa a proteinei G. Rata de disociere crește atunci când proteina G-GDP interacționează cu receptorul legat de agonist [Branot D.R., 1986]. Legarea GTP de către proteina G duce aparent la formarea unui complex agonist-receptor-proteină G. Analogul GTP-CTP-gamma-S și Mg 2+ îmbunătățește disocierea subunității alfa de trimerul proteinei G [Northup J.V., 1983]. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că subunitatea catalitică a adenilat-ciclazei din membranele creierului bovin este co-purificată cromatografic cu subunitățile alfa și beta ale proteinei G S [Marbach J., 1990] și problema disocierii subunităților alfa de la G. trimerul proteic pentru a activa efectorul necesită clarificare.

Proteinele G prezintă un polimorfism semnificativ. Fiecare dintre formele subunităților G-proteinei este foarte omoloagă ca structură, similară ca funcție, dar diferă în greutate moleculară și mobilitate electroforetică [Pertseva M.N., 1990]. Polimorfismul este deosebit de larg și cel mai studiat pentru proteinele alfa s și alfa i G. Astfel, din creierul uman au fost izolate 11 forme de ADNc responsabile de sinteza subunităților alfa s, dintre care patru tipuri au fost donate și se presupune că determină sinteza a patru izoforme alfa s în creierul uman [Bray P., 1986 ]. Pentru alfa i s-au găsit în principal trei izoforme: alfa i 1, alfa i 2, alfai 3. Masele moleculare ale izoformei alfa sunt în intervalul 42-55 kDa, iar alfa -39-41 kDa [Pertseva M.N., 1990]. Distribuția variantelor moleculare ale alfai este specifică țesuturilor: alfa i 1 este prezentat în principal în creier, alfa i 2 se găsește în țesutul nervos și celulele sanguine, alfa i 3 este prezentat în țesuturile periferice și este absent în creier [; Itoh I., 1988]. În ceea ce privește izoformele subunităților alfa ale proteinelor Gs, nu este încă clar dacă izoformele sunt codificate de gene structurale diferite sau dacă sunt produsul unei singure gene urmate de splicing alternativă internă a transcriptului ARN original [Robishaw J.D. , 1986], sau multiplicitatea lor este rezultatul modificării post-traducționale [Casey P.J., 1988]. În prezent, sunt cunoscute 9 gene structurale care codifică proteinele C și 12 produse ale acestor gene.

Idei generale despre căile de transducție a semnalului

Pentru majoritatea moleculelor de reglare, între legarea lor la un receptor membranar și răspunsul final al celulei, de exemplu. prin schimbarea funcționării acestuia se interpun serii complexe de evenimente - anumite căi de transmisie a semnalului, altfel numite prin căi de transducție a semnalului.

Substanțele de reglementare sunt de obicei împărțite în endocrine, neurocrine și paracrine. Endocrin regulatorii (hormoni) secretat de celulele endocrine în sânge și transportat de acesta către celulele țintă, care pot fi localizate oriunde în organism. Neurocrine regulatorii sunt eliberați de neuroni din imediata vecinătate a celulelor țintă. Paracrin substanțele sunt eliberate puțin mai departe de ținte, dar totuși suficient de aproape de acestea pentru a ajunge la receptori. Substantele paracrine sunt secretate de un tip de celula si actioneaza asupra altuia, dar in unele cazuri regulatorii sunt destinati celulelor care le-au secretat, sau celulelor vecine de acelasi tip. Se numeste autocrină regulament.

În unele cazuri, ultima etapă a transducției semnalului constă în fosforilarea anumitor proteine ​​efectoare, ceea ce duce la creșterea sau scăderea activității acestora, iar aceasta, la rândul său, determină răspunsul celular necesar organismului. Fosforilarea proteinelor se efectuează protein kinazeși defosforilarea - proteine ​​fosfataze.

Modificări ale activității protein kinazei apar ca urmare a legării unei molecule de reglare (denumită în general ligand) cu receptorul său membranar, care declanșează cascade de evenimente, dintre care unele sunt prezentate în figură (Fig. 2-1). Activitatea diferitelor proteine ​​kinaze este reglată de receptor nu direct, ci prin intermediul mesageri secundari(intermediari secundari), al căror rol îl joacă, de exemplu, AMP ciclic (AMPc), GMP ciclic (GMPc), Ca 2+, inozitol-1,4,5-trifosfat (IP 3)Și diacilglicerol (DAG).În acest caz, legarea ligandului de receptorul membranar modifică nivelul intracelular al celui de-al doilea mesager, care, la rândul său, afectează activitatea proteinei kinazei. Mulți reglementatori

Aceste molecule influențează procesele celulare prin căi de transducție a semnalului care implică proteine ​​care leagă GTP heterotrimerice (proteine ​​G heterotrimerice) sau proteine ​​monomerice de legare a GTP (proteine ​​G monomerice).

Când moleculele de ligand se leagă de receptorii membranari care interacționează cu proteinele G heterotrimerice, proteina G trece la o stare activă prin legarea de GTP. Proteina G activată poate interacționa apoi cu mulți proteine ​​efectoareîn primul rând de enzime precum adenilat ciclază, fosfodiesteraza, fosfolipaza C, A2Și D. Această interacțiune declanșează lanțuri de reacții (Fig. 2-1), care se termină cu activarea diferitelor proteine ​​kinaze, cum ar fi protein kinază A (PKA), protein kinază G (PKG), protein kinază C (PKI).

În termeni generali, calea de transducție a semnalului care implică proteine ​​G - protein kinaze include următorii pași.

1. Ligandul se leagă de un receptor de pe membrana celulară.

2. Receptorul legat de ligand, interacționând cu proteina G, o activează, iar proteina G activată leagă GTP.

3. Proteina G activată interacționează cu unul sau mai mulți dintre următorii compuși: adenilat ciclază, fosfodiesteraza, fosfolipaze C, A2, D, activând sau inhibându-le.

4. Nivelul intracelular al unuia sau mai multor mesageri secundi, cum ar fi cAMP, cGMP, Ca2+, IP3 sau DAG, crește sau scade.

5. O creștere sau scădere a concentrației celui de-al doilea mesager afectează activitatea uneia sau mai multor protein kinaze dependente de acesta, cum ar fi protein kinaza dependentă de cAMP (protein kinaza A), protein kinaza dependentă de cGMP (PKG), protein kinaza dependentă de calmodulină(CMPC), protein kinaza C. O modificare a concentrației celui de-al doilea mesager poate activa unul sau altul canal ionic.

6.Nivelul de fosforilare al unei enzime sau al unui canal ionic se modifică, ceea ce afectează activitatea canalului ionic, determinând răspunsul final al celulei.

Orez. 2-1. Câteva cascade de evenimente realizate în celulă datorită mesagerilor secundari.

Denumiri: * - enzimă activată

receptori membranari cuplați cu proteina G

Receptorii de membrană care mediază activarea dependentă de agonist a proteinelor G constituie o familie specială de proteine, cu mai mult de 500 de membri. Include α- și β-adrenergici, acetilcolină muscarinică, serotonină, adenozină, receptori olfactivi, rodopsina, precum și receptori pentru majoritatea hormonilor peptidici. Membrii familiei de receptori cuplați cu proteina G au șapte elice α transmembranare (Figura 2-2 A), fiecare conținând 22-28 de resturi de aminoacizi predominant hidrofobe.

Pentru unii liganzi, cum ar fi acetilcolina, epinefrina, norepinefrina și serotonina, sunt cunoscute diferite subtipuri de receptori cuplați cu proteina G. Ele diferă adesea în afinitatea lor pentru agoniştii şi antagoniştii competitivi.

În continuare este prezentată (Fig. 2-2 B) organizarea moleculară a adenilat-ciclazei, o enzimă care produce cAMP (primul al doilea mesager descoperit). Calea de reglare a adenilat-ciclazei este considerată calea clasică de transducție a semnalului mediată de proteina G.

Adenilat ciclaza servește ca bază pentru controlul pozitiv sau negativ al căilor de transducție a semnalului prin proteinele G. Într-un control pozitiv, legarea unui ligand stimulator, cum ar fi epinefrina, care acționează prin receptorii β-adrenergici, duce la activarea proteinelor G heterotrimerice cu subunitatea α de tip as („s” înseamnă stimulare). Activarea proteinelor G de tip Gs de către receptorul legat de ligand determină ca subunitatea sa să lege GTP și apoi să se disocieze de βγ-dimer.

Figura 2-2 B arată cum fosfolipaza C descompune fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat în inozitol 1,4,5-trifosfat și diacilglicerol. Ambele substanțe, inozitol 1,4,5-trifosfat și diacilglicerol, sunt mesageri secundari. IP3, prin legarea la canalele specifice de Ca 2+ dependente de ligand ale reticulului endoplasmatic, eliberează Ca 2+ din acesta, adică. crește concentrația de Ca 2+ în citosol. Diacilglicerolul, împreună cu Ca 2+, activează o altă clasă importantă de protein kinaze - protein kinaza C.

Apoi este prezentată structura unor mesageri secundi (Fig. 2-2 D-E): cAMP, GMP,

cGMP.

Orez. 2-2. Exemple de organizare moleculară a unor structuri implicate în căile de transducție a semnalului.

A este un receptor de membrană celulară care leagă un ligand pe suprafața exterioară și o proteină G heterotrimerică în interior. B - organizarea moleculară a adenilat-ciclazei. B - structura fosfatidilinozitol-4,5-difosfatului și inozitol-1,4,5-trifosfatului și diacilglicerolului format sub acțiunea fosfolipazei C. D - structura AMP ciclic 3",5" (activator protein kinazei A). D - structura HMF. E - structura GMP 3",5"-ciclic (activator protein kinazei G)

Proteine ​​G heterotrimerice

Proteina G heterotrimerică constă din trei subunități: α (40.000–45.000 Da), β (aproximativ 37.000 Da) și γ (8000–10.000 Da). Aproximativ 20 de gene diferite care codifică aceste subunități sunt acum cunoscute, incluzând cel puțin patru gene ale subunității p și aproximativ șapte gene ale subunității y de mamifere. Funcția și specificitatea unei proteine ​​G sunt de obicei, deși nu întotdeauna, determinate de subunitatea sa α. În majoritatea proteinelor G, subunitățile β și γ sunt strâns legate între ele. Unele proteine ​​G heterotrimerice și căile de transducție în care sunt implicate sunt enumerate în tabel. 2-1.

Proteinele G heterotrimerice servesc ca intermediari între receptorii membranei plasmatice pentru mai mult de 100 de substanțe reglatoare extracelulare și procesele intracelulare pe care le controlează. În termeni generali, legarea unei substanțe reglatoare de receptorul său activează proteina G, care fie activează, fie inhibă enzima și/sau declanșează un lanț de evenimente care conduc la activarea unor canale ionice specifice.

În fig. 2-3 prezintă principiul general de funcționare al proteinelor G heterotrimerice. În majoritatea proteinelor G, subunitatea α este „lucrătorul” proteinelor G heterotrimerice. Activarea majorității proteinelor G duce la o schimbare conformațională în această subunitate. Proteinele G inactive există în principal sub formă de heterotrimeri αβγ,

cu PIB în poziții de legare a nucleotidelor. Interacțiunea proteinelor G heterotrimerice cu receptorul atașat la ligand duce la conversia subunității α într-o formă activă cu afinitate crescută pentru GTP și afinitate redusă pentru complexul βγ. Ca rezultat, subunitatea α activată eliberează GDP, leagă GTP și apoi se disociază de βγ-dimer. Pentru majoritatea proteinelor G, subunitatea α disociată interacționează apoi cu proteinele efectoare în calea de transducție a semnalului. Cu toate acestea, pentru unele proteine ​​G, βγ-dimerul eliberat poate fi responsabil pentru toate sau unele dintre efectele complexului receptor-ligand.

Funcționarea unor canale ionice este modulată direct de proteinele G, adică. fără participarea mesagerilor secundari. De exemplu, legarea acetilcolinei de receptorii muscarinici M2 din inimă și unii neuroni duce la activarea unei clase speciale de canale K +. În acest caz, legarea acetilcolinei de receptorul muscarinic duce la activarea proteinei G. Subunitatea sa α activată se disociază apoi de βγ-dimerul, iar βγ-dimerul interacționează direct cu o clasă specială de canale K+, aducându-le în stare deschisă. Legarea acetilcolinei de receptorii muscarinici, care crește conductivitatea K+ a celulelor stimulatoare cardiace din nodul sinoatrial al inimii, este unul dintre principalele mecanisme prin care nervii parasimpatici provoacă o scădere a ritmului cardiac.

Orez. 2-3. Principiul de funcționare al proteinelor heterotrimerice care leagă GTP (proteinele G heterotrimerice).

Tabelul 2-1.Unele proteine ​​heterotrimerice de legare a GTP la mamifere, clasificate pe baza subunităților α*

* În cadrul fiecărei clase de subunități α se disting mai multe izoforme. Au fost identificate mai mult de 20 de subunități α.

Proteinele G monomerice

Celulele conțin o altă familie de proteine ​​de legare a GTP numite monomerică Proteine ​​care leagă GTP. Ele sunt cunoscute și ca Proteine ​​G cu greutate moleculară mică sau proteine ​​G mici(greutate moleculară 20.000-35.000 Da). Tabelul 2-2 enumeră subclasele majore de proteine ​​monomerice care leagă GTP și unele dintre proprietățile acestora. Proteinele monomerice de legare a GTP-like Ras și Rho-like sunt implicate în calea de transducție a semnalului în stadiul de transmitere a semnalului de la tirozin kinaza, receptorul factorului de creștere, la efectorii intracelulari. Printre procesele reglementate de căile de transducție a semnalului în care sunt implicate proteinele monomerice de legare a GTP se numără alungirea lanțului polipeptidic în timpul sintezei proteinelor, proliferarea și diferențierea celulelor, degenerarea lor malignă, controlul citoscheletului de actină, comunicarea între citoscheletul.

și matricea extracelulară, transportul veziculelor între diverse organele și secreția exocitotică.

Proteinele monomerice care leagă GTP, ca și omologii lor heterotrimerici, sunt comutatoare moleculare care există în două forme - activate „pornit” și inactivate „oprit” (Fig. 2-4 B). Cu toate acestea, activarea și inactivarea proteinelor monomerice de legare a GTP necesită proteine ​​de reglare suplimentare care, din câte se știe, nu sunt necesare pentru funcția proteinelor G heterotrimerice. Proteinele G monomerice sunt activate proteine ​​care eliberează nucleotide de guanină,și sunt inactivate Proteine ​​care activează GTPază. Astfel, activarea și inactivarea proteinelor monomerice care leagă GTP este controlată de semnale care modifică activitatea. proteine ​​care eliberează nucleotide de guanină sau Proteine ​​care activează GTPază mai degrabă decât prin țintirea directă a proteinelor G monomerice.

Orez. 2-4. Principiul de funcționare al proteinelor monomerice care leagă GTP (proteinele G monomerice).

Tabelul 2-2.Subfamilii de proteine ​​monomerice care leagă GTP și unele procese intracelulare reglementate de acestea

Mecanismul de funcționare al proteinelor G heterotrimerice

Proteinele G inactive există în principal sub formă de heterotrimeri αβγ, cu GDP la pozițiile lor de legare a nucleotidelor (Figura 2-5 A). Interacțiunea proteinelor G heterotrimerice cu receptorul atașat la ligand duce la transformarea subunității α într-o formă activă, care are o afinitate crescută pentru GTP și o afinitate scăzută pentru complexul βγ (Fig. 2-5 B). ). În majoritatea proteinelor G heterotrimerice, subunitatea α este structura care transmite informații. Activarea majorității proteinelor G duce la o schimbare conformațională a subunității α.

Ca rezultat, subunitatea α activată eliberează GDP, se leagă de GTP (Fig. 2-5 B) și apoi se disociază de βγ-dimer (Fig. 2-5 D). În majoritatea proteinelor G, subunitatea α disociată interacționează imediat cu proteinele efectoare (E 1) în calea de transducție a semnalului (Fig. 2-5 D). Cu toate acestea, pentru unele proteine ​​G, βγ-dimerul eliberat poate fi responsabil pentru toate sau unele dintre efectele complexului receptor-ligand. βγ-dimerul interacționează apoi cu proteina efectoră E2 (Fig. 2-5 E). Membrii familiei de proteine ​​RGS G sunt demonstrate în continuare că stimulează hidroliza GTP (Fig. 2-5 E). Aceasta inactivează subunitatea α și combină toate subunitățile într-un heterotrimer αβγ.

Orez. 2-5. Ciclul de funcționare al unei proteine ​​G heterotrimerice, care declanșează un lanț suplimentar de evenimente cu ajutorul acestuia.α -subunități.

Denumiri: R - receptor, L - ligand, E - proteina efectora

Căile de transducție a semnalului prin proteinele G heterotrimerice

Figura 2-6 A prezintă cei trei liganzi, receptorii lor cuplati la diferite proteine ​​G și țintele lor moleculare. Adenilat ciclaza este baza pentru controlul pozitiv sau negativ al căilor de transducție a semnalului care sunt mediate de proteinele G. Într-un control pozitiv, legarea unui ligand stimulator cum ar fi norepinefrina care acționează prin receptorii β-adrenergici duce la activarea proteinelor G heterotrimerice cu subunitatea α de tip α S („s” înseamnă stimulare). Prin urmare, o astfel de proteină G este numită proteină G de tip G S. Activarea proteinelor G de tip G s de către un receptor legat de ligand determină ca subunitatea sa α s să lege GTP și apoi să se disocieze de dimerul βγ.

Alte substanțe de reglare, cum ar fi epinefrina, care acționează prin receptorii a2, sau adenozina, care acționează prin receptorii a1, sau dopamina, care acționează prin receptorii D2, sunt implicate în controlul negativ sau inhibitor al adenilat-ciclazei. Aceste substanțe reglatoare activează proteinele G de tip G i, care au o subunitate α de tip α i („i” înseamnă inhibiție). Legarea unui ligand inhibitor la acesta

receptorul activează proteinele G de tip G i și provoacă disocierea subunității sale α i de dimerul βγ. Subunitatea α i activată se leagă de adenilat ciclază și îi suprimă activitatea. În plus, dimerii βγ pot lega subunitățile α s libere. În acest fel, legarea dimerilor βγ la subunitatea α s liberă suprimă în continuare stimularea adenilat-ciclazei, blocând acțiunea liganzilor stimulatori.

O altă clasă de agonişti extracelulari (Fig. 2-6 A) se leagă de receptorii care activează, printr-o proteină G numită G q, β-izoforma fosfolipazei C. El scindează fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (un fosfolipid prezent în cantităţi mici). în membrana plasmatică) la inozitol 1,4,5-trifosfat și diacilglicerol, care sunt mesageri secundari. IP 3, care se leagă de canalele specifice de Ca 2+ dependente de ligand ale reticulului endoplasmatic, eliberează Ca 2+ din acesta, adică. crește concentrația de Ca 2+ în citosol. Canalele de Ca 2+ reticulului endoplasmatic sunt implicate în cuplarea electromecanică în mușchiul scheletic și cardiac. Diacilglicerolul, împreună cu Ca 2+, activează protein kinaza C. Substraturile sale includ, de exemplu, proteine ​​implicate în reglarea diviziunii celulare.

Orez. 2-6. Exemple de căi de transducție a semnalului prin proteine ​​G heterotrimerice.

A - în cele trei exemple date, legarea unui neurotransmițător la un receptor duce la activarea proteinei G și la activarea ulterioară a căilor mesagerului secund. Gs, Gq și Gi se referă la trei tipuri diferite de proteine ​​G heterotrimerice. B - reglarea proteinelor celulare prin fosforilare duce la creșterea sau scăderea activității acestora, iar aceasta, la rândul său, determină reacția celulară necesară organismului. Fosforilarea proteinelor este efectuată de protein kinaze, iar defosforilarea este efectuată de proteine ​​​​fosfataze. Protein kinaza transferă o grupare fosfat (Pi) de la ATP la reziduurile de serină, treonină sau tirozină ale proteinelor. Această fosforilare schimbă în mod reversibil structura și funcția proteinelor celulare. Ambele tipuri de enzime, kinaze și fosfataze, sunt reglate de diferiți mesageri secundari intracelulari.

Căi de activare a protein kinazelor intracelulare

Interacțiunea proteinelor G heterotrimerice cu receptorul atașat la ligand duce la transformarea subunității α într-o formă activă, care are o afinitate crescută pentru GTP și o afinitate redusă pentru complexul βγ. Activarea majorității proteinelor G are ca rezultat o schimbare conformațională a subunității α, care eliberează GDP, leagă GTP și apoi se disociază de dimerul βγ. Subunitatea α disociată interacționează apoi cu proteinele efectoare în calea de transducție a semnalului.

Figura 2-7 A demonstrează activarea proteinelor heterotrimerice de tip G s cu subunitatea α de tip α s, care are loc datorită legării de ligandul receptor și duce la legarea subunității α s a proteinelor de tip G s. GTP și apoi se disociază de βγ-dimer și apoi interacționează cu adenilat ciclază. Acest lucru duce la o creștere a nivelurilor de cAMP și la activarea PKA.

Figura 2-7 B demonstrează activarea proteinelor heterotrimerice de tip G t cu subunitatea α de tip α t, care are loc datorită legării de ligandul receptor și duce la faptul că subunitatea α t de tip G t Proteinele G sunt activate și apoi se disociază de βγ-dimerul și apoi interacționează cu fosfodiesteraza. Acest lucru duce la o creștere a nivelurilor cGMP și la activarea PKG.

Receptorul de catecolamine α 1 interacționează cu subunitatea G αq, care activează fosfolipaza C. Figura 2-7 B demonstrează activarea proteinelor G heterotrimerice de tip G αq cu subunitatea α de tip α q, care are loc datorită legării a ligandului la receptor și conduce la activarea subunității α q a proteinelor G de tip G αq și apoi se disociază de dimerul βγ și apoi interacționează cu fosfolipaza C. Acesta scindează fosfatidilinozitol 4,5-difosfat în IP 3 și DAG. Acest lucru are ca rezultat o creștere a nivelurilor IP 3 și DAG. IP 3, se leagă de canalele specifice de Ca2+ dependente de ligand ale reticulului endoplasmatic,

eliberează Ca 2+ din acesta. DAG determină activarea proteinei kinazei C. Într-o celulă nestimulată, o cantitate semnificativă din această enzimă se află în citosol într-o formă inactivă. Ca 2+ face ca protein kinaza C să se lege de suprafața interioară a membranei plasmatice. Aici enzima poate fi activată de diacilglicerol, care se formează prin hidroliza fosfatidilinozitolului 4,5-bifosfat. Fosfatidilserina membranară poate fi, de asemenea, un activator al protein kinazei C dacă enzima este localizată în membrană.

Au fost descrise aproximativ 10 izoforme ale proteinei kinazei C. Deși unele dintre ele sunt prezente în multe celule de mamifere, subtipurile γ și ε se găsesc în principal în celulele sistemului nervos central. Subtipurile de protein kinaza C diferă nu numai prin distribuția lor în organism, ci, aparent, și prin mecanismele de reglare a activității lor. Unele dintre ele în celulele nestimulate sunt asociate cu membrana plasmatică, adică. nu necesită o creștere a concentrației de Ca 2+ pentru activare. Unele izoforme ale protein kinazei C sunt activate de acidul arahidonic sau de alți acizi grași nesaturați.

Activarea tranzitorie inițială a proteinei kinazei C are loc sub influența diacilglicerolului, care este eliberat atunci când fosfolipaza C β este activată și, de asemenea, sub influența Ca 2+ eliberat din depozitele intracelulare de IP 3 . Activarea de lungă durată a proteinei kinazei C este declanșată de fosfolipazele A 2 și D dependente de receptor. Acestea acționează în primul rând asupra fosfatidilcolinei, principalul fosfolipid membranar. Fosfolipaza A 2 separă de ea acidul gras din poziţia a doua (de obicei nesaturat) şi lizofosfatidilcolina. Ambele produse activează anumite izoforme ale proteinei kinazei C. Fosfolipaza D dependentă de receptor descompune fosfatidilcolina astfel încât se formează acidul fosfatidic și colina. Acidul fosfatidic este scindat în continuare la diacilglicerol, care este implicat în stimularea pe termen lung a protein kinazei C.

Orez. 2-7. Principiile de bază ale activării proteinei kinazei A, proteinei kinazei G și proteinei kinazei C.

Denumiri: R - receptor, L - ligand

protein kinaza dependentă de cAMP (protein kinaza A) și căile de semnalizare asociate

În absența cAMP, protein kinaza dependentă de cAMP (protein kinaza A) constă din patru subunități: două reglatoare și două catalitice. În majoritatea tipurilor de celule, subunitatea catalitică este aceeași, iar subunitățile de reglare sunt foarte specifice. Prezența subunităților de reglare suprimă aproape complet activitatea enzimatică a complexului. Astfel, activarea activității enzimatice a protein kinazei dependente de cAMP trebuie să implice disocierea subunităților de reglare din complex.

Activarea are loc în prezența concentrațiilor micromolare de AMPc. Fiecare subunitate reglatoare leagă două dintre moleculele sale. Legarea cAMP induce modificări conformaționale în subunitățile de reglare și reduce afinitatea interacțiunii lor cu subunitățile catalitice. Ca rezultat, subunitățile de reglare sunt separate de subunitățile catalitice, iar subunitățile catalitice devin activate. Subunitatea catalitică activă fosforilează proteinele țintă la reziduuri specifice de serină și treonină.

O comparație a secvențelor de aminoacizi ale claselor de protein kinaze dependente de cAMP și ale altor clase de protein kinaze arată că, în ciuda diferențelor puternice în proprietățile lor de reglare, toate aceste enzime sunt foarte omoloage în structura primară a părții mijlocii. Această parte conține domeniul de legare a ATP și locul activ al enzimei, care asigură transferul fosfatului de la ATP la proteina acceptor. Regiunile kinazei dincolo de această secțiune mediană catalitică a proteinei sunt implicate în reglarea activității kinazei.

De asemenea, a fost determinată structura cristalină a subunității catalitice a protein kinazei dependente de cAMP. Partea mediană catalitică a moleculei, prezentă în toate protein kinazele cunoscute, este formată din două părți. Porțiunea mai mică conține un situs neobișnuit de legare a ATP, iar porțiunea mai mare conține un situs de legare a peptidei. Multe protein kinaze conțin, de asemenea, o regiune de reglare cunoscută ca domeniul pseudosubstrat.În secvența de aminoacizi, seamănă cu regiunile fosforilabile ale proteinelor substrat. Domeniul pseudosubstrat, prin legarea la situsul activ al proteinei kinazei, inhibă fosforilarea substraturilor adevărate ale proteinei kinazei. Activarea kinazei poate implica fosforilarea sau modificarea alosterică necovalentă a proteinei kinazei pentru a elimina efectul inhibitor al domeniului pseudosubstrat.

Orez. 2-8. protein kinaza A dependentă de cAMP și ținte.

Când epinefrina se leagă de receptorul său corespunzător, activarea subunității α s stimulează adenilat ciclaza pentru a crește nivelul cAMP. cAMP activează protein kinaza A, care, prin fosforilare, are trei efecte principale. (1) Protein kinaza A activează glicogen fosforilază kinaza, care fosforilează și activează glicogen fosforilaza. (2) Protein kinaza A inactivează glicogen sintaza și astfel reduce formarea de glicogen. (3) Protein kinaza A activează inhibitorul fosfoprotein fosfatază-1 și astfel inhibă fosfataza. Efectul general este de a coordona modificările nivelurilor de glucoză.

Denumiri: UDP-glucoză - uridin difosfat glucoză

Reglarea hormonală a activității adenilat-ciclazei

Figura 2-9 A prezintă mecanismul principal al stimulării induse de hormoni și inhibării adenilat-ciclazei. Interacțiunea unui ligand cu un receptor asociat cu o subunitate α de tip α s (stimulator) determină activarea adenilat-ciclazei, în timp ce interacțiunea unui ligand cu un receptor asociat cu o subunitate α de tip α i (inhibitor) determină inhibarea enzima. Subunitatea G βγ este identică atât în ​​​​proteinele G stimulatoare, cât și în cele inhibitorii. Subunitățile și receptorii G α sunt diferiți. Formarea stimulată de ligand a complexelor active G α GTP are loc prin aceleași mecanisme atât în ​​proteinele G α, cât și în proteinele G αi. Cu toate acestea, G αs GTP și G αi GTP interacționează diferit cu adenilat ciclaza. Unul (G αs GTP) stimulează, iar celălalt G αi GTP) inhibă activitatea sa catalitică.

Figura 2-9 B prezintă mecanismul de activare și inhibare a adenilat-ciclazei induse de anumiți hormoni. Receptorii β 1 -, β 2 - și D 1 - interacționează cu subunități care activează adenilat ciclaza și cresc nivelurile de cAMP. Receptorii α 2 și D 2 interacționează cu subunitățile G αi, care inhibă adenilat ciclaza. (În ceea ce privește receptorul α 1, acesta interacționează cu subunitatea G, care activează fosfolipaza C.) Luați în considerare unul dintre exemplele prezentate în figură. Epinefrina se leagă de receptorul β 1, ceea ce duce la activarea proteinei G αs, care stimulează adenilat ciclaza. Aceasta duce la o creștere a nivelurilor intracelulare de AMPc și, astfel, crește activitatea PKA. Pe de altă parte, norepinefrina se leagă de receptorul α 2, ceea ce duce la activarea proteinei G αi, care inhibă adenilat ciclaza și, prin urmare, reduce nivelul intracelular al AMPc, reducând activitatea PKA.

Orez. 2-9. Activarea și inhibarea adenilat-ciclazei induse de ligand (hormon).

A este mecanismul fundamental. B - mecanism în raport cu hormonii specifici

Protein kinaza C și căile de semnalizare asociate

Receptorul α 1 interacționează cu subunitatea G αq a proteinei G, care activează fosfolipaza C. Fosfolipaza C scindează fosfatidilinozitol 4,5-difosfat în IP 3 și DAG. IP 3, care se leagă de canalele specifice de Ca 2+ dependente de ligand ale reticulului endoplasmatic, eliberează Ca 2+ din acesta, adică. crește concentrația de Ca 2+ în citosol. DAG determină activarea proteinei kinazei C. Într-o celulă nestimulată, această enzimă este inactivă în citosol.

formă. Dacă nivelul citosolic de Ca 2+ crește, Ca 2+ interacționează cu protein kinaza C, ceea ce duce la legarea proteinei kinazei C de suprafața interioară a membranei celulare. În această poziție, enzima este activată de diacilglicerol format în timpul hidrolizei fosfatidilinozitol-4,5-difosfatului. Fosfatidilserina membranară poate fi, de asemenea, un activator al protein kinazei C dacă enzima este localizată în membrană.

Tabelul 2-3 enumeră izoformele proteinei kinazei C de mamifere și proprietățile acestor izoforme.

Tabelul 2-3.Proprietăți ale izoformelor protein kinazei C de mamifere

DAG - diacilglicerol; PS - fosfatidilserina; FFA - acizi grași cis-nesaturați; LPC - lizofosfatidilcolină.

Orez. 2-10. Căile de semnalizare diacilglicerol/inozitol 1,4,5-trifosfat

Fosfolipaze și căi de semnalizare asociate folosind exemplul acidului arahidonic

Unii agonişti prin intermediul proteinelor G se activează fosfolipaza A2, care acționează asupra fosfolipidelor membranare. Produșii reacțiilor lor pot activa protein kinaza C. În special, fosfolipaza A 2 separă acidul gras situat în poziția a doua de fosfolipide. Datorită faptului că unele fosfolipide conțin acid arahidonic în această poziție, cauzat de fosfolipaza A 2, descompunerea acestor fosfolipide eliberează o cantitate semnificativă din acesta.

Calea de semnalizare descrisă mai sus a acidului arahidonic asociată cu fosfolipaza A2 este numită directă. Calea indirectă de activare a acidului arahidonic este asociată cu fosfolipaza C β.

Acidul arahidonic în sine este o moleculă efectoră și, în plus, servește ca precursor pentru sinteza intracelulară prostaglandine, prostacicline, tromboxaniȘi leucotriene- clase importante de molecule reglatoare. Acidul arahidonic se formează și din produșii de descompunere ai diacil-glicerinelor.

Prostaglandinele, prostaciclinele și tromboxanii sunt sintetizați din acidul arahidonic cale dependentă de ciclooxigenază,și leucotriene - cale dependentă de lipoxigenază. Unul dintre efectele antiinflamatorii ale glucocorticoizilor este tocmai inhibarea fosfolipazei A 2, care eliberează acidul arahidonic din fosfolipide. Acidul acetilsalicilic (aspirina ) și alte medicamente antiinflamatoare nesteroidiene inhibă oxidarea acidului arahidonic de către ciclooxigenază.

Orez. 2-11. Căile de semnalizare a acidului arahidonic.

Denumiri: PG - prostaglandina, LH - leucotriene, GPETE - hidroperoxieicosatetraenoat, GETE - hidroxieicosatetraenoat, EPR - reticul endoplasmatic

Calmodulină: structură și funcții

O varietate de procese celulare vitale, inclusiv eliberarea de neurotransmițători, secreția de hormoni și contracția musculară, sunt reglate de nivelurile citosolice de Ca2+. O modalitate prin care acest ion influențează procesele celulare este prin legarea sa de calmodulină.

Calmodulină- proteină cu greutatea moleculară de 16.700 (Fig. 2-12 A). Este prezent în toate celulele, uneori reprezentând până la 1% din conținutul total de proteine. Calmodulina leagă patru ioni de calciu (Fig. 2-12 B și C), după care acest complex reglează activitatea diferitelor proteine ​​intracelulare, dintre care multe nu sunt protein kinaze.

Complexul de Ca 2+ cu calmodulină activează, de asemenea, protein kinazele dependente de calmodulină. Protein kinazele specifice dependente de calmodulină fosforilează proteinele efectoare specifice, cum ar fi lanțurile ușoare de reglare a miozinei, fosforilaza și factorul II de alungire. Protein kinazele multifuncționale dependente de calmodulină fosforilează numeroase proteine ​​​​nucleare, citoscheletice sau membranare. Unele protein kinaze dependente de calmodulină, cum ar fi

Lanțul ușor de miozină și fosforilază kinaza acționează asupra unui singur substrat celular, în timp ce altele sunt multifuncționale și fosforilează mai mult de o proteină substrat.

Protein kinaza II dependentă de calmodulină este o proteină majoră a sistemului nervos. În unele zone ale creierului reprezintă până la 2% din proteinele totale. Această kinază este implicată în mecanismul în care o creștere a concentrației de Ca 2+ la nivelul terminalului nervos determină eliberarea unui neurotransmițător prin exocitoză. Substratul său principal este o proteină numită sinapsina I, prezent în terminațiile nervoase și se leagă de suprafața exterioară a veziculelor sinaptice. Când sinapsina I este legată de vezicule, previne exocitoza. Fosforilarea sinapsinei I face ca aceasta să se separe de vezicule, permițându-le să elibereze neurotransmițătorul în fanta sinaptică prin exocitoză.

Kinaza lanțului ușor de miozină joacă un rol important în reglarea contracției mușchilor netezi. O creștere a concentrației citosolice de Ca 2+ în celulele musculare netede activează miozin kinaza lanțului ușor. Fosforilarea lanțurilor ușoare de reglare a miozinei duce la contracția prelungită a celulelor musculare netede.

Orez. 2-12. Calmodulină.

A - calmodulină fără calciu. B - legarea calciului la calmodulină și peptida țintă. B - schema de conectare.

Denumiri: EF - Ca 2+ -domenii de legare ale calmodulinei

Receptori cu activitate enzimatică intrinsecă (receptori catalitici)

Hormonii și factorii de creștere se leagă de proteinele de suprafață celulară care au activitate enzimatică pe partea citoplasmatică a membranei. Figura 2-13 prezintă cele cinci clase de receptori catalitici.

Unul dintre exemplele tipice de transmembrană receptori cu activitate guanilat ciclază, receptorul peptidei natriuretice atriale (ANP). Receptorul membranar de care se leagă ANP este independent de sistemele de transducție a semnalului luate în considerare. Acţiunea agoniştilor extracelulari a fost descrisă mai sus, care, prin legarea la receptorii membranari, fie activează adenilat ciclaza prin proteinele Gs, fie o inhibă prin Gi. Receptorii de membrană pentru ANP sunt interesanți deoarece receptorii înșiși au activitate de guanilat ciclază, stimulată de legarea ANP de receptor.

Receptorii ANP au un domeniu extracelular de legare a ANP, o singură spirală transmembranară și un domeniu guanilat ciclază intracelular. Legarea ANP la receptor crește nivelurile intracelulare de cGMP, ceea ce stimulează protein kinaza dependentă de cGMP. Spre deosebire de protein kinaza dependentă de cAMP, care are subunități reglatoare și catalitice, domeniile reglatoare și catalitice ale protein kinazei dependente de cGMP sunt situate pe același lanț polipeptidic. Kinaza dependentă de cGMP apoi fosforilează proteinele intracelulare, ducând la diferite răspunsuri celulare.

Receptori cu activitate serin-treonin kinazei fosforilează proteinele numai la resturi de serină și/sau treonină.

O altă familie de receptori membranari non-cuplați cu proteina G constă din proteine ​​cu activitate tirozin-protein kinază intrinsecă. Receptorii cu propria activitate tirozin-protein kinază sunt proteine ​​cu un domeniu extracelular glicozilat, singurele

regiunea transmembranara si domeniul intracelular cu activitate tirozin-protein kinaza. Legarea unui agonist de ele, de ex. factorul de creștere a nervilor (NGF), stimulează activitatea tirozin-protein kinazei, care fosforilează proteinele efectoare specifice la anumite reziduuri de tirozină. Majoritatea receptorilor factorilor de creștere se dimerizează atunci când NGF se leagă de ei. Dimerizarea receptorului este cea care duce la apariția activității tirozin-protein kinazei. Receptorii activați se fosforilează adesea, ceea ce se numește autofosforilare.

Spre superfamilie receptori peptidici includ receptorii de insulină. Acestea sunt, de asemenea, tirozin protein kinaze. În subclasa de receptori aparținând familiei receptorilor de insulină, receptorul neligandat există ca un dimer legat de disulfură. Interacțiunea cu insulina duce la modificări conformaționale în ambii monomeri, ceea ce crește legarea insulinei, activează receptorul tirozin kinaza și duce la creșterea autofosforilării receptorului.

Legarea unui hormon sau a unui factor de creștere de receptorul său declanșează o varietate de răspunsuri celulare, inclusiv intrarea Ca 2+ în citoplasmă, creșterea metabolismului Na + /H +, stimularea absorbției de aminoacizi și zahăr, stimularea fosfolipazei C β și hidroliza fosfatidilinozitol difosfatului.

Receptorii hormon de creștere, prolactinăȘi eritropoietina, la fel ca receptorii interferonși multe citokine, nu servesc direct ca protein kinaze. Cu toate acestea, după activare, acești receptori formează complexe de semnalizare cu tirozin-protein kinaze intracelulare, care declanșează efectele lor intracelulare. De aceea nu sunt receptori adevărați cu propria lor activitate tirozin-protein kinază, ci pur și simplu se leagă de ei.

Pe baza structurii, se poate presupune că transmembrană tirozin protein fosfataze sunt de asemenea receptori, iar activitatea lor tirozin-protein fosfatază este modulată de liganzi extracelulari.

Orez. 2-13. Receptorii catalitici.

A - receptor guanil ciclază, B - receptor cu activitate serin-treonin kinază, B - receptor cu activitate tirozin-protein kinază proprie, D - receptori asociați cu activitate tirozin-protein kinază

Proteine ​​tirozin kinaze asociate receptorilor folosind exemplul receptorilor de interferon

Receptorii de interferon nu sunt direct protein kinaze. Odată activați, acești receptori formează complexe de semnalizare cu tirozin-protein kinaze intracelulare, care declanșează efectele lor intracelulare. Adică, nu sunt receptori adevărați cu propria lor activitate tirozin-protein kinază, ci pur și simplu se leagă de ei, așa-numiții receptori. tirozin-protein kinaze asociate receptorilor (dependente de receptor).

Mecanismele prin care acești receptori își exercită efectele sunt declanșate atunci când un hormon se leagă de receptor, determinându-l să se dimerizeze. Un dimer receptor leagă unul sau mai mulți membri Ianus-familie de protein tirozin kinaze (JAK). JAK apoi cruce

se fosforilează reciproc precum şi receptorul. Membrii familiei traductoare de semnal și activatori ai transcripției (STAT) leagă domenii fosforilate pe receptor și complexul JAK. Proteinele STAT sunt fosforilate de kinazele JAK și apoi disociate de complexul de semnalizare. Proteinele STAT fosforilate formează în cele din urmă dimeri care se deplasează către nucleu pentru a activa transcripția anumitor gene.

Specificitatea receptorului pentru fiecare hormon depinde în parte de specificitatea membrilor familiei JAK sau STAT care se combină pentru a forma complexul de semnalizare. În unele cazuri, complexul de semnalizare activează, de asemenea, cascada kinazei MAP (proteina de activare a mitogenului) prin proteinele adaptoare utilizate de receptorii tirozin kinaze. Unele dintre răspunsurile ligandului receptorului tirozin kinazei implică, de asemenea, căile JAK și STAT.

Orez. 2-14. Exemplu de receptori catalitici asociați cu activitatea protein tirozin kinazei. receptor α-activat -interferon (A) șiγ - interferon (B)

Proteinele G monomerice asemănătoare Ras și căile lor de transducție mediate

Un ligand, cum ar fi un factor de creștere, se leagă de un receptor care are propria activitate a proteinei tirozin kinazei, rezultând o transcriere crescută într-un proces în 10 etape. Proteine ​​monomerice de legare a GTP asemănătoare Ras participă la calea de transducție a semnalului în stadiul de transmitere a semnalului de la receptorii cu propria lor activitate tirozin-protein kinază (de exemplu, receptorii factorului de creștere) la efectorii intracelulari. Activarea și inactivarea proteinelor monomerice de legare a GTP necesită proteine ​​de reglare suplimentare. Proteinele G monomerice sunt activate de proteinele care eliberează nucleotide de guanină (GNRP) și inactivate de proteinele de activare a GTPază (GAP).

Proteinele monomerice de legare a GTP din familia Ras mediază legarea liganzilor mitogeni și a receptorilor lor tirozin-protein kinazei, care declanșează procese intracelulare care conduc la proliferarea celulară. Când proteinele Ras sunt inactive, celulele nu răspund la factorii de creștere care acționează prin receptorii tirozin kinazei.

Activarea Ras declanșează o cale de transducție a semnalului, conducând în cele din urmă la transcrierea anumitor gene care promovează creșterea celulelor. Cascada MAP kinazei (MAPK) este implicată în răspunsuri la activarea Ras. Protein kinaza C activează, de asemenea, cascada MAP kinazei. Astfel, cascada MAP kinazei pare a fi un punct important de convergență pentru o varietate de efecte care induc proliferarea celulară. Mai mult, există o încrucișare între protein kinaza C și tirozin kinaze. De exemplu, izoforma y a fosfolipazei C este activată prin legarea la proteina Ras activată. Această activare este transmisă proteinei kinazei C în procesul de stimulare a hidrolizei fosfolipidelor.

Figura 2-15 prezintă un mecanism care include 10 etape.

1. Legarea ligandului duce la dimerizarea receptorului.

2. Proteina tirozin kinaza activată (RTK) se fosforilează singură.

3.GRB 2 (proteina-2 legată de receptorul factorului de creștere), o proteină care conține SH 2, recunoaște reziduurile de fosfotirozină pe receptorul activat.

4. Conectarea GRB 2 include SOS (fiul lui Sevenless) proteină de schimb de nucleotide de guanină.

5.SOS activează Ras formând GTP pe Ras în loc de GDP.

6. Complexul activ Ras-GTP activează alte proteine ​​prin încorporarea fizică a acestora în membrana plasmatică. Complexul activ Ras-GTP interacționează cu porțiunea N-terminală a serin-treonin kinazei Raf-1 (cunoscută sub numele de proteină de activare a mitogenului, MAP), prima dintr-o serie de protein kinaze activate care transmit un semnal de activare celulei. nucleu.

7.Raf-1 fosforilează și activează o protein kinază numită MEK, care este cunoscută sub numele de MAP kinaze kinaze (MAPKK). MEK este o protein kinază multifuncțională care fosforilează substraturile de tirozină și reziduuri de serină/treonină.

8.MEK fosforilează MAP kinaza (MAPK), care este, de asemenea, declanșată de kinaza de reglare a semnalului extracelular (ERK 1, ERK 2). Activarea MAPK necesită fosforilare dublă pe reziduurile de serină și tirozină adiacente.

9. MAPK servește ca o moleculă efectoră critică în transducția semnalului dependentă de Ras, deoarece fosforilează multe proteine ​​celulare după stimularea mitogenă.

10. MAPK-ul activat este translocat în nucleu, unde fosforilează factorul de transcripție. În general, Ras activat activează MAP

prin conectarea cu ea. Această cascadă are ca rezultat fosforilarea și activarea MAP kinazei, care, la rândul său, fosforilează factorii de transcripție, substraturile proteice și alte proteine ​​kinaze importante pentru diviziunea celulară și alte răspunsuri. Activarea Ras depinde de legarea proteinelor adaptoare la domeniile fosfotirozină de pe receptorii activați de factor de creștere. Aceste proteine ​​adaptoare se leagă și activează GNRF (proteina de schimb de nucleotide de guanină), care activează Ras.

Orez. 2-15. Reglarea transcripției de către proteinele G monomerice asemănătoare Ras, declanșate de un receptor cu propria activitate tirozin-protein kinază

Reglarea transcripției prin proteina care interacționează cu elementul ADN dependent de cAMP (CREB)

CREB, un factor de transcripție larg distribuit, este în mod normal asociat cu o regiune a ADN numită CRE (element de răspuns cAMP).În absența stimulării, CREB este defosforilat și nu are efect asupra transcripției. Numeroase căi de transducție a semnalului prin activarea kinazelor (cum ar fi PKA, Ca 2+ /calmodulin kinaza IV, MAP kinaza) conduc la fosforilarea CREB. CREB fosforilat se leagă C.B.P.(proteina care leagă CREB- CREB-binding protein), care are un domeniu de stimulare a transcripției. În paralel, fosforilarea activează PP1

(fosfoprotein fosfataza 1), care defosforilează CREB, ducând la oprirea transcripției.

S-a demonstrat că activarea mecanismului mediat de CREB este importantă pentru implementarea funcțiilor cognitive superioare precum învățarea și memoria.

Figura 2-15 arată, de asemenea, structura PKA dependentă de cAMP, care în absența cAMP constă din patru subunități: două reglatoare și două catalitice. Prezența subunităților reglatoare suprimă activitatea enzimatică a complexului. Legarea cAMP induce modificări conformaționale în subunitățile de reglare, ducând la separarea subunităților de reglare de subunitățile catalitice. PKA catalitic intră în nucleul celulei și inițiază procesul descris mai sus.

Orez. 2-16. Reglarea transcripției genelor de către CREB (proteina de legare a elementului de răspuns cAMP) printr-o creștere a nivelului de adenozin monofosfat ciclic

Ciclul de activare a proteinei G de către receptorul cuplat cu proteina G.

Proteinele G sunt o familie de proteine ​​GTPază care funcționează ca mesageri secundi în cascadele de semnalizare intracelulară. Proteinele G sunt numite astfel deoarece mecanismul lor de semnalizare utilizează înlocuirea GDP cu GTP ca un „comutator” funcțional molecular pentru a regla procesele celulare.

Poveste

Proteinele G au fost descoperite și studiate de Alfred Gilman și Martin Rodbell, care au primit în 1994 Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină pentru descoperirea lor.

Tipuri de proteine ​​G

Proteinele G sunt împărțite în două grupuri principale - heterotrimerice și „mici”. Proteinele G heterotrimerice sunt proteine ​​cu structură cuaternară, formate din trei subunități: alfa, beta și gamma. Proteinele G mici sunt proteine ​​dintr-un singur lanț polipeptidic, au o greutate moleculară de 20-25 kDa și aparțin superfamiliei Ras a GTPazelor mici. Lanțul lor polipeptidic unic este omoloage subunității α a proteinelor G heterotrimerice. Ambele grupuri de proteine ​​G sunt implicate în semnalizarea intracelulară.

Proteine ​​G heterotrimerice

Toate proteinele G heterotrimerice au un mecanism de activare similar: ele sunt activate prin interacțiunea cu receptori specifici cuplați cu proteina G, schimbând GDP cu GTP și descompunându-se în subunități α și βγ. Subunitatea α legată de GTP acționează pe următoarea verigă din lanțul de transducție a semnalului. Subunitatea βγ poate provoca, de asemenea, propriile efecte. Inactivarea proteinelor G are loc ca urmare a hidrolizei lente a GTP la GDP de către subunitatea α, după care are loc reasociere a subunităților.